1、放線菌的抗生素抗性篩選方法是一種很有效的開發(fā)放線菌生物活性物質(zhì)產(chǎn)生潛力的方法，具有效率高、目的性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，具有良好的研究和應(yīng)用價值。本研究通過三重抗生素抗性法對土壤中分離得到的放線菌進(jìn)行篩選，旨在為菌種篩選工作提供一條高效、簡便的新路。
　　 首先對內(nèi)蒙古呼倫貝爾市、福建省仙游縣、江西省豐城市以及浙江省富陽市內(nèi)的4個樣區(qū)所采集的土壤樣品進(jìn)行自然干燥等預(yù)處理后，采用含有2 μg/mL青霉素及75 μg/mL重鉻酸鉀的高氏一號培養(yǎng)基

2、進(jìn)行放線菌的初步分離。共分離得到20株放線菌。然后采用鏈霉素(Streptomycin)、慶大霉素(Gentamicin)及利福平(Rifampicin)三重抗性法對所得到的放線菌進(jìn)行進(jìn)一步篩選。最終得到一株放線菌，它對鏈霉素抗性為40 μg/mL、慶大霉素抗性為10 μg/mL、利福平抗性為150 μg/mL。并初步命名為1號放線菌。
　　 將1號放線菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，并對其產(chǎn)生物活性物質(zhì)的最佳適發(fā)酵天數(shù)進(jìn)行研究，每隔24 h做

3、鏡檢觀察菌絲體生長情況，測定發(fā)酵液pH,測定生物量，并取不同天數(shù)的發(fā)酵液用于生物活性測定等試驗(yàn)。最終確定1號放線菌在該發(fā)酵條件下的最適發(fā)酵時間為10 d。
　　 以枯草芽孢桿菌ATCC 6633（Bacillus subtilis）以及藤黃微球菌ATCC 9341(Micrococcus
　　 luteus)做為活性檢測菌，用單層杯碟法測定1號放線菌的發(fā)酵液上清及菌體浸提液活性，用游標(biāo)卡尺測其抑菌圈直徑。結(jié)果得出：1號放

4、線菌的發(fā)酵液上清及菌體沉淀浸提液對枯草芽孢桿菌和藤黃微球菌均有抑制活性，對藤黃微球菌的抑制活性大于枯草芽孢桿菌；發(fā)酵液上清活性大于菌體沉淀浸提液。
　　 分別將發(fā)酵液上清以及菌體浸提液與本實(shí)驗(yàn)室自行表達(dá)純化得到的天冬酰胺合成酶反應(yīng)，測其對該酶的抑制活性。結(jié)果顯示，1號放線菌的發(fā)酵液上清及菌體沉淀浸提液對天冬酰胺合成酶均顯示了很強(qiáng)的抑制活性，發(fā)酵液上清活性大于菌體沉淀浸提液。
　　 分別對發(fā)酵液上清以及菌體浸提液用不同溫度

5、處理不同時間以及調(diào)節(jié)不同pH值處理，測定處理前后的抑菌活性，以測定其活性物質(zhì)穩(wěn)定性。結(jié)果顯示：該放線菌的發(fā)酵液上清在50 ℃水浴條件下處理1 h后，其抑菌活性基本喪失，而pH小于4或大于9的酸堿度處理也都會使其失活；相反，菌體浸提液經(jīng)過90 ℃水浴1.5 h以及pH達(dá)到2和11的處理后其活性仍然穩(wěn)定。
　　 采用細(xì)菌基因組DNA的小量制備方法提取該放線菌DNA。經(jīng)純化后采用通用引物進(jìn)行16SrDNA基因的PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物測