1、<p><b>　　畢業(yè)論文開題報告</b></p><p><b>　　生物技術(shù)</b></p><p>　　海藻酪氨酸酶的分離純化及性質(zhì)研究</p><p>　　1. 課題研究意義及國內(nèi)外研究現(xiàn)狀</p><p>　　酪氨酸酶又稱多酚氧化酶,廣泛存在于微生物、動植物和人體,它具有單酚酶

2、活性和二酚酶活性。在機體內(nèi)它能將L2酪氨酸羥化，產(chǎn)生鄰位二羥基苯丙氨酸( L2多巴) ，再將多巴氧化成多巴醌,進而生成一系列引起褐化的色素類物質(zhì)。是皮膚黑素生物合成的關(guān)鍵酶,不僅決定黑素合成的速率, 還是黑素細胞分化成熟的特征性標志。酪氨酸酶是一種含銅的金屬酶, 每1個亞基含2個金屬銅離子,2個銅離子分別與蛋白質(zhì)分子中組氨酸結(jié)合,另有1 個內(nèi)源橋基將2個銅離子聯(lián)系在一起,構(gòu)成酪氨酸酶催化氧化反應(yīng)活性中心。酪氨酸等物質(zhì)與酶形成過渡態(tài)絡(luò)合物

3、時,主要是羥基與酶的活性中心上的原子鍵合而發(fā)生作用。</p><p>　　它的活性與黑色素的生成有密切的關(guān)系。酪氨酸酶的分布與動物的生理功能息息相關(guān),不同動物的酪氨酸酶在體內(nèi)分布的部位不同。多數(shù)昆蟲在正常生理狀態(tài)下,酪氨酸酶以酶原的形式存在,不同類型的酪氨酸酶存在于昆蟲的特定部位,以完成特定的生理功能。哺乳動物酪氨酸酶催化產(chǎn)生的黑色素被分泌進入到表皮和毛發(fā)的角質(zhì)細胞中，使體表著色,從而起保護皮膚和眼睛、抵御紫外線

4、的輻射和防止內(nèi)部組織過熱等作用，哺乳動物酪氨酸酶常見于黑素細胞中，黑素細胞是存在于皮膚,發(fā)囊和眼睛中并產(chǎn)生色素的高度特異性的細胞，酪氨酸酶功能減退或缺失時,即會影響黑色素代謝，從而發(fā)生疾病如白癲瘋和白化病，動物與人的常染色體隱性疾病也與酪氨酸酶的缺失或活性下降有關(guān)。</p><p>　　近年來黑色素在防紫外線輻射、清除自由基、作為無定形半導(dǎo)體、化妝品、以及生物殺蟲劑的光保護劑等方面都具有廣闊的應(yīng)用前景。酪氨酸酶的

5、抑制劑可被作為化妝品中的增白劑如熊果甙和曲酸,因此可以以酪氨酸酶作為研究對象尋找更好的美白劑。同時,人們一直在研究酪氨酸酶活性的抑制劑和激活劑,為色素沉著、黑色素瘤以及白癜風等色素疾病的預(yù)防和治療尋找新的手段。目前,對酪氨酸酶的研究主要集中在酶的分離純化、催化機制、活性調(diào)控以及酪氨酸酶基因及其在生物體內(nèi)的生理作用等方面,并且人們已經(jīng)從微生物、植物及多種動物中提取并純化了酪氨酸酶。</p><p>　　寧波是沿海城

6、市，海藻資源及其豐富，已有的研究表明：海藻中含有的脂類、苷類、氨基酸、酸類、多肽、胡蘿卜素、甾類等生物活性物質(zhì)，其藥用和美容功能正被逐步研究開發(fā)。尤其是海藻多糖種類繁多、來源豐富，它不僅能提高機體免疫功能，而且具有抗腫瘤、抗病毒、抗輻射、降血脂及抗凝血等多種生物活性。</p><p>　　將地方的豐富資源—海藻充分利用起來，將其用于酪氨酸酶的提取純化，同時將其內(nèi)的活性物質(zhì)與酪氨酸酶的生物學(xué)活性合并研究，探究其相互

7、作用，為進一步研制出新型藥物和化妝品等提供理論依據(jù)。</p><p>　　2. 課題研究的主要內(nèi)容、預(yù)期目標和研究方案</p><p><b>　　主要研究內(nèi)容：</b></p><p>　　1 海藻酪氨酸酶的提取純化工藝的研究;包括粉碎勻漿、沉淀離心、鹽析、透析、離子交換、分子篩等純化條件的研究。</p><p>　　

8、2 海藻酪氨酸酶的生物學(xué)特性研究：包括分子量、最適pH 值和最適溫度、Km 和Vmax、熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性、離子穩(wěn)定性等。</p><p>　　3 海藻中常見生物活性物質(zhì)對酪氨酸酶活性的作用：包括脂類物質(zhì)、多肽氨基酸類、萜類、甾類、多糖類物質(zhì)對酪氨酸酶的影響，重點研究海藻多糖的影響效果及利用。</p><p><b>　　項目預(yù)期目標：</b></p>

9、<p>　　1相關(guān)研究論文2-3篇。</p><p><b>　　2爭取專利1項</b></p><p>　　實施方案：1海藻酪氨酸酶的提取純化工藝的研究。</p><p>　　1.1通過對單因素實驗，進行工藝流程的探索研究，最佳離心條件；最佳鹽析試劑及濃度；最佳透析時間；最佳離子交換梯度洗脫濃度、洗脫速度、洗脫時間；最佳分子篩分離

10、條件的設(shè)置等。</p><p>　　1.2通過正交實驗對分離純化工藝流程進行優(yōu)化</p><p>　　2海藻酪氨酸酶的生物學(xué)性質(zhì)研究：</p><p>　　2.1利用SDS-PAGE 電泳檢測蛋白純度和測定分子量。</p><p>　　2.2采用Bradford 法測定蛋白質(zhì)含量。</p><p>　　2.3以不同pH

11、(4. 0～10. 0) 的Tris-HCl 緩沖液為介質(zhì),在30 ℃下測定酪氨酸酶活性，測定其最適pH值。</p><p>　　2.4在最適pH條件、不同溫度(15～80 ℃) 下測定酪氨酸酶活性,作溫度- 酶活性變化曲線，求出最適溫度。</p><p>　　2.5　酶的動力學(xué)研究。以L2DOPA 為底物,改變底物濃度(1～8 mmol/ L) ,在最適溫度和pH 條件下測定酶在不同底物

12、濃度時的酶活力,并按Lineweaver-Burk 作圖,求出Km、Vmax。</p><p>　　3 酪氨酸酶的穩(wěn)定性研究：</p><p>　　3.1　酶的pH 穩(wěn)定性研究：將一定量的酶分別保存在不同pH(4. 0～10. 0) 的Tris2HCl 緩沖液中,30 ℃放置24 h ,然后在最適pH和溫度條件下測定其活性,作出pH - 酶活性變化曲線。</p><p&

13、gt;　　3.2　酶的溫度穩(wěn)定性研究:將一定量的酶分別放置在不同溫度(20、40、60、80 ℃) 下,分別保溫20、40、60 min ,并在最適pH和溫度條件下測定其酶活性,作出溫度- 酶活性變化曲線。</p><p>　　3.3 酶的離子穩(wěn)定性研究：向酶液中分別加入10 mmol/ L ,1 mmol/ L 的Al3 + 、Ca2 + 、Co + 、Cu2 + 、Mn2 + 、Mg2 + 、Zn2 + 離子

14、,于50 ℃保溫一段時間,在最適pH和溫度條件下測定上述金屬離子對其酶活性的影響。</p><p>　　4 海藻中常見活性物質(zhì)對酪氨酸酶活性的影響：</p><p>　　4.1海藻氨基酸對酪氨酸酶的影響。</p><p>　　4.2海藻脂類物質(zhì)對酪氨酸酶的影響。</p><p>　　4.3海藻中萜類和甾類化合物對酪氨酸酶的影響。</p&

15、gt;<p>　　4,4海藻多糖對酪氨酸酶的影響。</p><p><b>　　3. 課題進度計劃</b></p><p>　　2010年4月-7月：篩選提取酪氨酸酶的最佳常見海藻種類</p><p>　　2010年8月-10月：確定海藻提出、分離、純化酪氨酸酶的最佳實驗方法和條件</p><p>　　20

16、10年11月-12月：海藻酪氨酸酶提取工藝條件優(yōu)化</p><p>　　2011年1月- 4月：海藻酪氨酸酶的性質(zhì)研究</p><p>　　2011年5月-2012年4月：海藻中常見活性物質(zhì)對酪氨酸酶活性的影響</p><p><b>　　4. 參考文獻</b></p><p>　　[1]劉曉丹,黃璜,陳清西. 苯甲酸對

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