1、<p>　　得分：_______</p><p>　　南 京 林 業(yè) 大 學(xué)</p><p><b>　　研究生課程論文</b></p><p>　　2015 ～20016 學(xué)年 第二學(xué)期</p><p>　　二○一六 年 六 月</p><p><b>　　內(nèi)容</

2、b></p><p>　　本文研究松材線蟲、松墨天牛和真菌在松樹中的共生關(guān)系</p><p><b>　　實(shí)驗(yàn)材料和方法：</b></p><p><b>　　（1）真菌</b></p><p>　　小長喙霉在PDA平板上、25℃條件下培養(yǎng)一周，使用前在5℃條件下保存。</p>

3、<p>　　灰葡萄孢在10 mL的大麥籽粒上培養(yǎng)。</p><p><b>　?。?）線蟲</b></p><p>　　強(qiáng)毒蟲株松材線蟲T-4在25℃條件下在灰葡萄孢上培養(yǎng)，使用前在5℃條件下保存。松材線蟲懸濁液包括成蟲和幼蟲，懸濁液濃度為50000條/mL。</p><p><b>　?。?）昆蟲</b><

4、;/p><p>　　松墨天牛在恒定條件下培養(yǎng)（25℃，16h光照、8h黑暗），讓其繁殖10代，第七代到第十代成蟲用來在赤松小苗上產(chǎn)卵，收集天牛所產(chǎn)的卵并將其放置在濕紙巾上，在一天之內(nèi)孵化的幼蟲用于實(shí)驗(yàn)。</p><p><b>　?。?）松枝</b></p><p>　　2014年六月采伐兩顆12年生（胸徑分別為3.9和5.2cm）的赤松和兩顆12

5、年生的黑松（胸徑分別為8.1和9.0cm），分別在實(shí)驗(yàn)1和實(shí)驗(yàn)3中使用。2015年二月采伐3顆12年生的赤松用于實(shí)驗(yàn)2，胸徑分別為7.4、7.6和8.4cm，2014年十月采伐一顆12年生的赤松用于實(shí)驗(yàn)4，其胸徑為6.8cm。樹枝截為15cm一段，在樹枝的兩端用石蠟密封起來，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組樹枝的樹木特定的每組樹枝之間不存在顯著差異</p><p><b>　　(5)接種</b></p>

6、;<p>　　使用鑿子和鑷子在離樹端13.7mm處從木質(zhì)部分離樹皮（面積22.3mm×17.3mm），用刻刀在漏出的木質(zhì)部中間挖一個(gè)直徑6-7mm圓形刻槽用以放置松墨天牛幼蟲，一份帶有灰葡萄孢或則沒有灰葡萄孢的面積為5×5mm的PDA培養(yǎng)基放置在遠(yuǎn)離樹端、接近圓形刻槽的位置。用到劃長16.8mm、最大寬度為14.3mm的三角形裂口，在漏出的韌皮部接種20uL的線蟲懸濁液（1000條線蟲）或者是無菌純凈水

7、。兩個(gè)樹皮傷口最小距離平均為13.7mm，兩個(gè)傷口接種后覆蓋原來的樹皮，用封口膜包起來，即使不接種松墨天牛幼蟲，也挖一個(gè)小刻槽，實(shí)驗(yàn)4中松樹枝條不用接種松材線蟲懸液或水，不會(huì)在樹皮上形成傾斜傷口。</p><p><b>　　實(shí)驗(yàn)一、</b></p><p>　　為了確定松墨天牛幼蟲和小長喙霉對(duì)松材線蟲種群生長的影響，一組赤松枝條接種松材線蟲、松墨天牛和小喙長霉。第二

8、組枝條接種松材線蟲、松墨天牛和PDA，第三組枝條接種松材線蟲和小喙長霉，第四組枝條接種松材線蟲和PDA。他們被垂直放置使線蟲遠(yuǎn)離容器底部。25℃，16h光照、8h黑暗，相對(duì)濕度100%條件下常溫培養(yǎng)，用純凈水保持濕度。</p><p>　　接種18天后，從松枝上剝離樹皮，從枝條上取幼蟲和幼蟲糞便，記錄韌皮部和木質(zhì)部上藍(lán)變面積確定小喙長霉的繁殖情況，從縱向韌皮部上剝離四份之一到二分之一的樹皮，將樹皮外層剝離，收集里

9、面樹皮以獲得韌皮部樣品，再將里層樹皮的韌皮部剪切為1-2mm大小的樹皮塊，使用一把15mm寬的刀片，從接種松墨天牛幼苗和松材線蟲的地方包括髓取木質(zhì)部樣品，記錄木質(zhì)部樣品真菌繁殖情況，糞便、韌皮部和木質(zhì)部分別在25℃下使用貝爾曼漏斗法分離48-72h，計(jì)算分離線蟲濃度，材料在60℃下烘5-12d，稱重，線蟲密度表示每克材料干重中松材線蟲的數(shù)量。</p><p>　　分別使用電子天平和游標(biāo)卡尺測量幼蟲體重和頭殼寬度，

10、分別精確到0.1mg和0.05mm，根據(jù)頭殼寬度確定幼蟲齡期：0.585–1.170,1.260–1.935, 1.980–3.150和3.150–4.365 mm分別為一齡、二齡、三齡和四齡蟲。</p><p><b>　　實(shí)驗(yàn)二、</b></p><p>　　確定赤松中韌皮部、木質(zhì)部和天牛幼蟲蛀屑線蟲密度的不同，在2015年2月26日將剛孵化的幼蟲、1000條松材

11、線蟲和一份接有小長喙霉的PDA接種在10條直徑相似的上述赤松枝條上，2015年3月26日分別將韌皮部、木質(zhì)部和幼蟲蛀屑用以分離線蟲，確定線蟲密度，</p><p><b>　　實(shí)驗(yàn)三、</b></p><p>　　確定松材線蟲種群和小喙長霉對(duì)松墨天牛生長發(fā)育的影響，四組黑松枝條接種松材線蟲、松墨天牛和小喙長霉三個(gè)物種組成的四種組合。方法和實(shí)驗(yàn)一方法相同，培養(yǎng)條件相同。

12、</p><p>　　每天觀察松枝，記錄松墨天牛羽化情況，分性別記錄成蟲數(shù)量，體重和鞘翅長分別精確到0.1mg和0.05mm。沒有松墨天牛出現(xiàn)的松枝在接種153-164d后分離，稱量幼蟲的鮮重和記錄頭寬、顏色、腸內(nèi)排泄物的有無以及幼蟲所在的位置。</p><p><b>　　實(shí)驗(yàn)四、</b></p><p>　　為確定松墨天牛幼蟲對(duì)小喙長霉繁殖

13、的影響，6個(gè)赤松枝條接種小喙長霉和松墨天牛幼蟲，接種22d后，剝離松枝樹皮，幼蟲蛀屑和幼蟲取樣，測量幼蟲體重和頭殼寬度</p><p><b>　　文章結(jié)構(gòu)</b></p><p><b>　　設(shè)計(jì)思路</b></p><p><b>　　實(shí)驗(yàn)一</b></p><p>　　為

14、研究赤松枝條中松墨天牛幼蟲和小喙長霉菌對(duì)松材線蟲種群的影響，實(shí)驗(yàn)選取年齡和粗度相似的赤松為材料，分四組實(shí)驗(yàn)進(jìn)行，一組赤松實(shí)驗(yàn)材料只接種松材線蟲、一組赤松材料接種松材線蟲和松墨天牛，一組赤松材料接種松材線蟲和小喙長霉菌，最后一組赤松實(shí)驗(yàn)材料接種松材線蟲、松墨天牛和小喙長霉菌，四組實(shí)驗(yàn)之間彼此形成對(duì)照，通過測量不同接種組合、不同部位的松材線蟲密度和松墨天牛的體重和頭寬指標(biāo)來確定三者之間的相互影響。</p><p>&

15、lt;b>　　實(shí)驗(yàn)二</b></p><p>　　為研究韌皮部、木質(zhì)部和天牛幼蟲糞便中線蟲密度的不同，剛孵化的松墨天牛、松材線蟲和小喙長霉菌接種在10個(gè)粗細(xì)相似的赤松枝條上，按照實(shí)驗(yàn)一發(fā)法在各部位取樣，測定松材線蟲密度。</p><p><b>　　實(shí)驗(yàn)三</b></p><p>　　為研究松材線蟲種群和小喙長霉菌對(duì)松墨天牛生

16、長發(fā)育的影響，在四組黑松實(shí)驗(yàn)材料上按照實(shí)驗(yàn)一中接種方法接種松材線蟲、松墨天牛和小喙長霉菌三個(gè)物種的組合。每天觀察記錄松墨天牛成蟲出現(xiàn)情況，測定體重和鞘翅長度指標(biāo)。在接種后153-164天后，解剖沒有松墨天牛出現(xiàn)的松樹枝條，稱量記錄活天牛幼蟲的頭寬、身體顏色、排泄物狀態(tài)和其在松樹枝條內(nèi)所在的位置。</p><p><b>　　實(shí)驗(yàn)四</b></p><p>　　研究松墨

17、天牛對(duì)小喙長霉菌影響，6個(gè)赤松枝條接種松墨天牛和小灰長霉菌，24天后，在接種位置上剝離樹皮，從松樹枝條上取下幼蟲和幼蟲糞便，取整個(gè)松樹枝條四分之一到二分之一的樹皮（包括天牛取食過的樹皮，不包括石蠟覆蓋的樹皮）去除外層樹皮，韌皮部切成1-2cm寬的小塊，使用手鉆在接種松墨天牛和小喙長霉菌的位置取韌皮部包括髓，松墨天牛糞便、韌皮部和木質(zhì)部放在聚乙烯袋子里，-20℃下保存，兩天后，在真空狀態(tài)下凍干。測定麥角固醇含量。</p>&

18、lt;p><b>　　結(jié)果和結(jié)論</b></p><p><b>　　實(shí)驗(yàn)一</b></p><p>　　在接種18天后，解剖松樹枝條，在樹皮下發(fā)現(xiàn)20只活的天牛幼蟲和4只死的天牛幼蟲，活天牛幼蟲包括1個(gè)一齡幼蟲、2個(gè)二齡幼蟲和17個(gè)三齡幼蟲，平均體重99.2mg，平均頭殼寬2.23mm，在幼蟲腸道內(nèi)發(fā)現(xiàn)糞便。解剖實(shí)驗(yàn)表明在單獨(dú)接種松材線蟲

19、的11個(gè)松樹枝條中有6個(gè)松樹枝條可觀察到小喙長霉菌，在接種松材線蟲和人松墨天牛的12個(gè)松樹枝條中有9個(gè)松樹枝條可觀察到小灰長霉菌，在單獨(dú)接種小灰長霉菌的所有松樹枝條上的木質(zhì)部和韌皮部均有真菌分布。在未接種松墨天牛幼蟲的松樹枝條，木質(zhì)部和韌皮部的分別分離到線蟲量為2.2g和2.9g，在接種松墨天牛幼蟲的松樹枝條上，木質(zhì)部、韌皮部和糞便中分別分離到3.6g、3.2g和0.29g松材線蟲。平均線蟲密度隨接種位置、松墨天牛幼蟲及真菌的有無而不同

20、，在未接種真菌的松樹枝條木質(zhì)部的松材線蟲密度小于其他接種位置的松材線蟲密度，小于接種真菌的松樹枝條。未接種松墨天牛幼蟲的松樹枝條線蟲密度大于接種松墨天牛幼蟲的松樹枝條線蟲密度。雙因素方差分析表明，在接種松墨天牛幼蟲的受接種位置和真菌有無影響，但不受接種位置和真菌互作影響，松材線蟲密度在糞便中最大，其次為木質(zhì)部，最小為韌皮部</p><p><b>　　實(shí)驗(yàn)二</b></p>&

21、lt;p>　　在接種剛孵化的松墨天牛幼蟲的赤松枝條中存在天牛糞便，解剖發(fā)現(xiàn)9個(gè)活的天牛和1個(gè)死亡的天牛幼蟲，活天牛幼蟲平均體重為118.4mg，頭殼寬2.19mm，表明活天牛為三齡幼蟲，死亡天牛頭殼寬為1.35mm，說明此為二齡幼蟲，解剖實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在10個(gè)松樹枝條的韌皮部存和5個(gè)松樹枝條的部分木質(zhì)部存在真菌。韌皮部、木質(zhì)部和糞便線蟲密度為5.3g、3.3g和0.52g。雙因素方差分析表明，線蟲密度受接種位置影響，但不受松樹枝條影響，

22、松材線蟲密度最大為天牛糞便、其次為韌皮部和木質(zhì)部。</p><p><b>　　實(shí)驗(yàn)三</b></p><p>　　在接種幼蟲后的71天到167天期間出現(xiàn)23只雌天牛和30只雄天牛，在接種后153-164天后解剖松樹枝條發(fā)現(xiàn)在木質(zhì)部蛹室內(nèi)發(fā)現(xiàn)11只活天牛幼蟲和9只死亡天牛幼蟲，活天牛幼蟲平均體重為982.3mg，頭殼寬為3.89mm，體色為黃白色到黃色，表明他們是四齡

23、幼蟲。方差分析表明成蟲的體重不受真菌接種實(shí)驗(yàn)、線蟲接種、性別、樹皮面積和彼此之間互作關(guān)系影響。方差分析也表明天牛鞘翅長度受真菌和松材線蟲互作關(guān)系、真菌、松材線蟲和樹皮面積三者互作關(guān)系的影響，但是不受真菌、線蟲和樹皮面積的影響。雌天牛的鞘翅比雄天牛鞘翅長。鞘翅長度與樹皮面積呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。方差分析顯示接種天牛幼蟲后，天牛成蟲出現(xiàn)時(shí)間不受真菌、線蟲、樹皮面積和天牛性別以及彼此之間互作關(guān)系的影響。</p><p><

24、;b>　　實(shí)驗(yàn)四</b></p><p>　　在接種22天后，在松樹枝條發(fā)現(xiàn)6只活天牛幼蟲，平均體重171.2mg，平均頭殼寬為2.4mm，表明他們?yōu)槿g幼蟲。天牛糞便的麥角固醇含量最大，其次為韌皮部和木質(zhì)部，方差分析顯示三者之間存在極顯著差異。</p><p><b>　　創(chuàng)新性</b></p><p><b>　

25、　指導(dǎo)意義</b></p><p>　　實(shí)驗(yàn)過程控制單因素變量，實(shí)驗(yàn)測定的指標(biāo)多樣，可以從不同角度反映實(shí)驗(yàn)結(jié)果，實(shí)驗(yàn)分析多樣化，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)多次篩選，層層分析，增加數(shù)據(jù)可靠性。</p><p><b>　　不足之處</b></p><p>　　實(shí)驗(yàn)中只考慮線蟲取食小喙長霉菌，沒有考慮線蟲取食松樹枝條活細(xì)胞的</p><

26、;p>　　實(shí)驗(yàn)四研究松墨天牛對(duì)小喙長霉菌影響，實(shí)驗(yàn)中在6個(gè)赤松枝條上均接種松墨天牛幼蟲和小喙長霉菌，但未在赤松枝條上單獨(dú)接種小喙長霉菌作為對(duì)照。</p><p>　　References</p><p>　　Akbulut S, Linit MJ (1999) Flight performance of Monochamus carolinensis (Coleoptera: Cer

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