1、2024/2/11,1,第 3 講 人類疾病動物模型復制及評價,Animal Models of Human Diseases,2,一、定義模型（Model）動物模型（Animal models）人類疾病動物模型(Animal models of human diseases） 是指為生物醫(yī)學研究和闡明人類疾病的病因、發(fā)病機理，建立預防、診斷和治療方法而制作的具有人類疾病模擬表現(xiàn)的實驗動物。,第一節(jié) 動

2、物模型概述,3,為什么要在動物身上試驗==在人身上試驗的問題受倫理學制約，許多實驗不能直接在人體上進行以人本身作為實驗對象來推動醫(yī)學發(fā)展是緩慢的臨床所積累的經(jīng)驗在時間和空間上都存在著局限性,一個好的疾病動物模型的建立可極大地促進該疾病發(fā)病機理、診斷、預防及治療研究并開發(fā)出相關新藥；而一種疑難病、烈性傳染病，因為無相應的動物模型，限制了該病的深入研究。,4,二、應用疾病動物模型的意義減少了在人身上進行實驗所帶來的風險；縮短實驗研

3、究周期；便于實驗樣品的收集；便于研究結果分析；可提供稀缺疾病的材料；全面認識疾病的本質(zhì),5,三、疾病動物模型的制作原則（1）確定性：能通過各種觀察指標得到明確診斷；（2）完整性：能顯示某種疾病從發(fā)病到轉歸的整個變化過程；（3）重復性：相近條件下，能夠復制和再現(xiàn)；（4）規(guī)范性：有基本同一的操作規(guī)程、技術參數(shù)與觀察指標等；（5）實用性：對藥物療效和安全性評價、臨床診治工作有意義等；（6）易行性：常規(guī)動物和試劑，

4、制作方法簡便，儀器設備普及，價格適中。,6,動物模型評價的注意點：動物體畢竟不是人體的真實摹本，沒有一種動物模型能完全復制人類疾病的狀況。模型實驗只是一種間接性研究。2.對動物模型實驗結果的評價應是相對的，不可絕對外推的人身上，最終必須在人體上得到驗證。,7,四、人類疾病動物模型的分類（一）按制作方法的分類 誘發(fā)性疾病動物模型 突變系疾病動物模型1.自發(fā)性疾病動物2.人工致突變疾病動物 轉基因動物疾病模型,8,不同人類

5、疾病動物模型的比較,9,（二）按照各系統(tǒng)疾病分類 可分為呼吸系統(tǒng)疾病動物模型、消化系統(tǒng)疾病動物模型……等。（三）按照疾病基本病理過程分類 可分為發(fā)熱、炎癥、休克、電解質(zhì)紊亂、酸堿平衡障礙、嘔吐、腹瀉動物模型……等。（四）按照所用動物進行分類 例如小鼠模型、大鼠模型等。 （五）中醫(yī)證候動物模型的分類 利用中醫(yī)獨特理論體系“辨證論治”，在實驗動物身上復制不同的臨床證候，以不同的證型表現(xiàn)出來，如氣虛證、血

6、虛證動物模型等。,第二節(jié) 腫瘤動物模型 1.自發(fā)性腫瘤動物模型2.誘發(fā)性腫瘤動物模型3.移植性腫瘤動物模型,1. 自發(fā)性腫瘤動物模型 ◆ 指實驗動物未經(jīng)任何有意識的人工處置，在自然情況下發(fā)生的腫瘤所形成的模型。 ◆ C3H小鼠： 10月齡乳腺癌發(fā)病率為97% 14月齡雄性，肝癌自發(fā)率達84% ◆ AKR小鼠： 淋巴細胞性白血病發(fā)病率為70%～90%；

7、◆雌性F344大鼠： 乳腺腫瘤發(fā)病率為41%,◆ 注 意：1. 適合做實驗研究的動物自發(fā)性腫瘤，應選擇最接近于人類的腫瘤。2. 缺點：自發(fā)性腫瘤發(fā)病遲，發(fā)病時期不集中，發(fā)病率也不一致。,2. 誘發(fā)性腫瘤（induced tumor）動物模型◆ 是使用致癌因素在實驗條件下誘發(fā)動物發(fā)生腫瘤的模型?！?方法： 1）原位誘發(fā)：指將致癌物直接與動物靶組織或靶器官接觸而誘發(fā)該組織或器官發(fā)生腫瘤，接觸方法可通過涂

8、抹、灌注、喂養(yǎng)或埋置等 。 2）異位誘發(fā)：將與致癌物接觸后的動物組織或器官埋置于該動物或另一正常動物皮下而產(chǎn)生的該組織或器官的腫瘤。異位誘發(fā)腫瘤具有易于觀察和取材的優(yōu)點。,◆ 誘癌物： 放射線局部照射、化學致癌物（烷化劑、亞硝胺類、芳香胺類）、生物毒素（黃曲霉毒素）、細菌（幽門螺桿菌）感染等。,◆ 舉 例： （1）二乙基亞硝胺(DEN)誘發(fā)小鼠肺癌： 采用小鼠皮下注射1％DEN水溶液，每周一次，(每次

9、劑量為56mg/kg，總劑量為868mg)。觀察時間為100d左右。此模型誘發(fā)率約40%。若將DEN總劑量增到1176mg時，半年誘發(fā)率可達90％以上。 （2）亞胺基偶氮甲苯(OAAT)誘發(fā)小鼠肝癌： 用l％OAAT苯溶液涂于動物兩肩胛間皮膚上，隔日1次，每次2—3滴、一般涂100次。7個月以上誘發(fā)肝腫瘤約55％。 （3）黃曲霉素誘發(fā)大鼠肝癌： 在大鼠飼料中加入黃曲霉素，含0.011-0.015ppm，喂養(yǎng)6個月，

10、誘發(fā)率達80％。,◆ 注 意：1.致瘤方法、動物種系、致癌物種類與溶劑、給藥劑量與途徑及觀察時間等盡量簡便可行，有較好的重復性，并有利于與人腫瘤比較。2.方法和種系應對所用致瘤物敏感。3.致癌物的劑量應能保證動物存活率較高、誘發(fā)期較短而又可誘發(fā)較高頻率的腫瘤。,3. 移植性腫瘤動物模型 ◆ 指將動物或人體腫瘤移植同種或異種動物連續(xù)傳代而培養(yǎng)出的模型。 ◆ 方法 實體瘤移植：腫瘤細胞皮下接種——7-10d

11、處死荷瘤動物——選擇生長良好、無壞死液化的瘤組織——無菌套管針抽吸——接種同種受體動物右前腋窩皮下。 腹水瘤移植：腫瘤細胞腹腔接種——7-10d處死荷瘤動物——取腹水——腹腔注射（腹水瘤）或皮下注射（實體瘤）。,◆ 人體腫瘤的異種移植：,A: 移植于動物缺乏免疫防御機能的特殊部位 雞胚、動物眼前房、地鼠頰囊。B: 人工制造免疫缺陷動物 切除新生動物胸腺、脾臟、射線照射、免疫抑制劑。C: 移植于先天性免疫缺陷動物

12、無胸腺裸鼠（nude）,◆ 國內(nèi)、外的科學家已經(jīng)建立起許多不同起源和不同特性的可移植性腫瘤細胞系或株。目前世界上大約保有近500種動物移植瘤株，但常用的只有40種，且多數(shù)為小鼠腫瘤，其次是大鼠和倉鼠移植瘤株。,http://cellbio.com.cn,http://www.bnbio.com/,◆常用的可移植性腫瘤細胞系（或株）：小鼠肉瘤S-180、肉瘤37（S-37）、小鼠淋巴細胞白血病L-1210、艾氏腹水瘤、小鼠網(wǎng)織細胞白血病6

13、15、Harding-Passey黑色素瘤、黑色素瘤B-16、小鼠肝癌H22、Lewis肺癌、小鼠乳腺癌（M5076）、大鼠Walker-256和吉田肉瘤等。,第三節(jié) 糖尿病動物模型,一、Ⅰ型糖尿病動物模型,二、Ⅱ型糖尿病動物模型,一、Ⅰ型糖尿病動物模型,(一)手術方法（胰腺切除法）1890年報道：切除狗胰腺，出現(xiàn)多尿，多飲，多食和嚴重的糖尿現(xiàn)象。一般選用較大的實驗動物，如狗和家兔等，其次用大鼠。全切：無胰，需補充外源性胰酶

14、?？梢鸶哐?，并可致酮癥酸中毒和死亡一般主張切除75%~90%的胰。,(二)化學藥物特異性破壞胰島β細胞1.四氧嘧啶（alloxan） 產(chǎn)生超氧自由基而破壞β細胞，導致胰島素合成減少，胰島素缺乏。豚鼠具有抗藥性。血糖反應3個時相：①早期血糖升高,持續(xù)約2ｈ②低血糖約6ｈ③ 12ｈ后開始持久的高血糖,⑴小鼠：劑量——200mg/kg(ip) ,85-100 mg/ kg(iv)。 隨劑量的增加，小

15、鼠死亡率增高; 小鼠體重增加，死亡率亦增高; 靜脈注射成模率比腹腔注射高; 同等劑量分次給藥，死亡率、轉陰率均降低，成模率高。 最佳時間為禁食12--18ｈ后造模。 造模劑均需臨用前配。,成模標準：造模后第3天CBG值>16.7ｍmol/l。,⑵大鼠：影響因素：飼料成分、給藥次數(shù)、給藥劑量、動物體重、個體差異等。靜脈給藥優(yōu)于腹腔給藥；兩步給藥法：劑量

16、為第1天120 mg/kg，第2天100 mg/kg。,⑶小型豬：5%四氧嘧啶200 mg/kg靜脈注射，出現(xiàn)高血糖，糖耐量減低，糖尿，低蛋白血癥，腎上腺皮質(zhì)損傷。,⑷家兔：雌性較雄性耐受，死亡少，130 mg/kg為適宜。,2. 鏈脲佐菌素(streptozotocin) 三個時相：①早期高血糖相，持續(xù)約1~2小時，乃此藥抑制胰島釋放所致；②低血糖相，持續(xù)約6~10小時，可能是由于胰島β細胞破壞，大量胰島素釋放，是血糖顯著降低

17、；③24小時后出現(xiàn)穩(wěn)定的高血糖相即糖尿病階段，此時大部分胰島β細胞已呈現(xiàn)不同程度的損傷和破壞。與四氧嘧啶糖尿病不同，高血糖反應及酮癥均較緩和----死亡較少。,⑴小鼠：敏感性較差，需靜脈注射175~200mg/kg方可引起糖尿病。,⑵大鼠：速發(fā)型模型：Wistar大鼠， ip 60mg/kg STZ， 1次遲發(fā)型模型：Wistar大鼠，每周1次，連續(xù)3周，ip CFA （福氏完全佐劑）0. 5m1和STZ (25mg/k

18、g)，。,⑶豚鼠： ip STZ 200mg/kg，24h后每天定時SC.2U長效胰島素，6周后血糖明顯提高，血清胰島素明顯減少。,(三)手術及藥物聯(lián)合制作糖尿病模型,(四)病毒誘導方法柯薩奇病毒可使新生的小鼠、田鼠等致病，對成年鼠不致病。選用DBA2雌性小鼠，皮下接種腦炎、心肌炎病毒Ｍ型變異株，4～7ｄ后出現(xiàn)明顯的高血糖，伴有血中及胰腺中胰島素含量降低。,(五)自發(fā)性Ⅰ型糖尿病動物模型,1.NOD小鼠：是JCL -IC

19、R品系小鼠衍生的CTS(白內(nèi)障易感亞系)糖尿病小鼠近親雜交而來，其發(fā)病多突然，表現(xiàn)明顯多飲、多尿、消瘦，血糖顯著升高，不用胰島素治療，動物存活不了一個月，通常死于酮血癥。高果糖飲食等可預防NOD小鼠糖尿病發(fā)作。NOD小鼠的糖尿病發(fā)病率與性別有關，雌性鼠發(fā)病率顯著高于雄性鼠且發(fā)病早。,2.BB糖尿病大鼠 ：是從Wistar大鼠中篩選出來的一種自發(fā)性、遺傳性糖尿病動物模型。發(fā)作是突然的，大約在60～120日齡時發(fā)病，數(shù)天后，糖

20、尿病動物出現(xiàn)嚴重的高血糖,低胰島素和酮血癥。免疫抑制劑、新生鼠胸腺切除等可預防糖尿病的發(fā)生。由于BB鼠能模擬人類Ⅰ型糖尿病的自然發(fā)病、病程發(fā)展和轉歸，且沒有外來因素的參與和干擾，是一種十分理想的Ⅰ型糖尿病動物模型。,3.LEW.1NR1/ztm-iddm大鼠 是Lewis大鼠MHC單倍型自發(fā)突變株,自發(fā)性自身免疫Ⅰ型糖尿病動物模型。58ｄ左右發(fā)病,發(fā)病率為20%,性別不影響發(fā)病率。特點是高血糖、糖尿、酮尿和多尿。,二、Ⅱ型糖尿

21、病動物模型,(一)化學藥物損傷1.一次性大劑量STZ注射 小鼠STZ 65mg/kg體重,可致空腹血糖明顯上升 。2.多次小劑量STZ注射⑴金黃地鼠：連續(xù)腹腔注射小劑量鏈脲佐菌素3天，劑量為40mg/kg，于注射后1、2、3、4、8周測動物血糖、血脂，成模。⑵大鼠：用STZ處理的新生大鼠成年后將呈典型的Ⅱ型糖尿病表現(xiàn)。自發(fā)性高血壓鼠(SHR)在新生期予以STZ處理，成年可獲得Ⅱ型糖尿病合并原發(fā)性高血壓模型。,(二)STZ

22、加膳食誘導的模型 少量STZ, 同時飼以高脂肪飼料, 誘導出接近人類Ⅱ型糖尿病的動物模型。1.小鼠 ：高脂肪飼料喂養(yǎng)Ｃ57BL/6Ｊ雄性斷乳小鼠3周，ip STZ，繼續(xù)喂養(yǎng)4周成模。2.大鼠： 雌性Wistar大鼠喂以高糖高脂飼料(其中含10%蔗糖,10%豬油,5%膽固醇)一個月，誘發(fā)出胰島素抵抗，繼以低劑量鏈菌素(STZ，25 mg/kg，ip) 2次，每周1次，誘發(fā)胰島素代償性分泌障礙，使之產(chǎn)生高血糖癥，是Ⅱ型糖尿病

23、血管并發(fā)癥的理想模型。高脂高糖飼料（蛋白質(zhì)5%、碳水化合物60%其中蔗糖為30%、脂肪32%其中煉豬油為30%）高脂飼料（在10kｇ標準飼料中加入150ｇ食鹽、50ｇ白糖、2000ｇ豬油、400ｇ麻油、2000ｇ花生、雞蛋900ｇ,碳水化合物48%,脂肪22%,蛋白質(zhì)20%。）,(三)特殊膳食誘導1.大鼠： Wistar大鼠飲用12%的果糖水，連續(xù)六個月，形成了明顯的胰島素抵抗，因此認為該模型是糖尿病實驗研究的一種適用動

24、物模型。2.家兔： 家兔飼以高糖、高脂誘發(fā)糖尿病飼料(10%豬油、37%白蔗糖混合53%基礎飼料)單籠飼養(yǎng),每只動物每天約喂食100ｇ飼料,自由飲水，室溫18～25℃,實驗期為32周。3.小型豬： 3～4月齡,體重6.02±1.29kg/頭的貴州小型豬，雌、雄各半，飼以高脂高糖飼料(10%豬油、37%蔗糖、混合53%基礎飼料)，單欄飼養(yǎng),每頭動物每天按體重的2.5%喂食飼料,自由飲水,室溫18～25℃,實驗期為

25、6個月。成模。,(五)自發(fā)性Ⅱ型糖尿病動物模型1.KK小鼠 輕度肥胖型Ⅱ型糖尿病動物，從5周齡起,血糖、血循環(huán)中的胰島素水平以及HbA1ｃ水平逐步升高。脂肪組織的胰島素敏感性降低，且到16周齡時完全喪失。腎臟病變發(fā)生早,發(fā)展迅速,腎小球基底膜增厚。2.ob/ob小鼠Ⅱ型糖尿病動物模型，屬常染色體隱性遺傳。純合體動物表現(xiàn)為肥胖,高血糖及高胰島素血癥。3. db/db小鼠屬Ⅱ型糖尿病模型。動物在一個月時開始貪食及發(fā)胖,繼而產(chǎn)

26、生高血糖、高血胰島素,胰高血糖素也升高。一般在10個月內(nèi)死亡。,4.NSY小鼠近交系自發(fā)性糖尿病模型，與人的NIDDM發(fā)病機理相似。5. Zucker fa/fa大鼠 是典型的高胰島素血癥肥胖模型。6.黑線倉鼠 俗稱中國地鼠(Chinesehamster),原為我國黃河以北一些省份的優(yōu)勢鼠種。這種動物模型為非肥胖型,以中輕度高血糖為特征,血清胰島素表現(xiàn)多樣，胰島病變程度不一，類似于人類的Ⅱ型糖尿病。7.GK大鼠GK大鼠

27、也是一種自發(fā)的Ⅱ型糖尿病鼠種8.嗜沙肥鼠,三、檢測指標(一)一般性指標 糖尿病時會導致動物攝食量、飲水量增加和血清葡萄糖、膽固醇、甘油三酯、游離脂肪酸、糖化血紅蛋白、乳酸分泌增高,而血清胰島素、紅細胞胰島素受體最大親和力、糖耐量降低。測定上述指標可反映實驗動物是否產(chǎn)生高血糖或患糖尿病。(二)其他生化和免疫學指標可應用ELISA測定TNF-α、INF-γ、IL-４等細胞因子和免疫球蛋白IgE（反映細胞凋亡情況）;還可

28、測定內(nèi)皮素（ET）和NO（反映氧自由基產(chǎn)生情況）、Ang-Ⅱ和（AT-１）mRNA（反映血管變化及間接反映氧自由基產(chǎn)生情況）、IGF-１即胰島素樣生長因子-１和瘦素（了解胰島素的分泌,間接反映氧自由基情況）、AGEｓ即糖基化產(chǎn)物（反映體內(nèi)氧化應激和糖基化反應情況）、PAH即苯丙氨酸羥化酶（反映糖異生的快慢）、GAD即谷氨酸脫羧酶抗體（該抗體陽性,表明細胞自身免疫性破壞）、胰島素抗體（抗體陽性,說明胰島素分泌不足）、Ｃ肽（反映胰島β細胞的

29、功能）等。,三、檢測指標](三)病理切片及形態(tài)學檢查 STZ型糖尿病可見胰腺外分泌大量灶狀或散在的單核細胞,胰島細胞空泡變性,使胰島呈空虛狀態(tài),胰島毛細血管擴張、充血、胰島細胞減少。而Alloxan型糖尿病則見部分胰島形狀不規(guī)則,邊緣不整齊,胰島β細胞排列紊亂,個別胰島只剩下幾個細胞環(huán)繞在胰島周邊部分,亦可見不規(guī)則花環(huán)狀等各種形態(tài),有的胰島內(nèi)β細胞所剩無幾,幾乎成為空泡狀,僅能辨認其輪廊。自發(fā)性糖尿病模型病理切片主要觀察胰島淋巴細