1、目標產(chǎn)品的蛋白質(zhì)分析檢測技術(shù)與質(zhì)量控制,曹純潔,2,主要內(nèi)容,蛋白質(zhì)含量和純度氨基酸的分析蛋白質(zhì)的分子量測定蛋白質(zhì)的等電點肽譜蛋白質(zhì)突變點的分析蛋白質(zhì)的二硫鍵的分析,3,一、蛋白質(zhì)含量和純度,蛋白質(zhì)濃度測定的方法：凱氏定氮法（繁瑣）、TCA比濁法、雙縮脲法（需樣品量大,不夠靈敏）、福林-酚法和紫外線法。已知摩爾消光系數(shù)時，可準確的計算出蛋白濃度：公式A=εCL。 L為內(nèi)徑。C為摩爾濃度。摩爾消光系數(shù)（ ε ）的定義為：在

2、特定條件下，一定波長的光，光徑為1.00cm時，通過所含吸光物質(zhì)的濃度為1.00 mol/L時的吸光度。 未知摩爾消光系數(shù)時，可測280nm和260nm光吸收值，用公式蛋白質(zhì)濃度（mg/ml）=1.55A280-0.76A260 =1.45A280-0.74A260,4,考馬斯蘭G-250法：此試劑在酸性條件下與蛋白反應(yīng)，當吸收峰由465nm轉(zhuǎn)移到595nm，靈

3、敏度高，測定蛋白的濃度范圍廣。遺傳工程產(chǎn)品蛋白質(zhì)的純度要求：95%、99%、99.9%。常用鑒定蛋白純度的方法：聚丙烯酰胺凝膠電泳和SDS-PAGE、毛細管電泳（CE）、等電聚焦（IEF）、HPLC（包括凝膠過濾、各種反相HPLC、離子色譜、疏水色譜）,5,五種蛋白質(zhì)測定方法比較,6,新的方法：如質(zhì)譜法，僅pmol的樣品就能測定，同時能給出分子量。注意：只用一種鑒定蛋白純度的方法是不夠，往往幾種 （方法，機理）結(jié)合使用。,7,二、

4、氨基酸分析,檢測法的種類：氨基酸進行UV檢測只能利用羧基（-COOH）在200～210nm處的吸收。一部分具有苯環(huán)的氨基酸也可在250～280nm檢測，但是，一般對原物質(zhì)（氨基酸）進行高靈敏度、良好選擇性的分析比較困難。 因此，很早以來就使用衍生法，利用許多氨基酸構(gòu)造中存在的氨基（-NH2，-NHR），使用與該基團可進行選擇性反應(yīng)的衍生試劑。檢測的儀器：HPLC或氨基酸分析儀,8,兩類方法：柱后反應(yīng)法：將游離的氨基酸經(jīng)色譜柱分

5、離后，氨基酸再與顯色劑（茚三酮[吸光度檢測]、熒光胺、鄰苯二甲醛[熒光檢測]）作用，然后導入檢測器。優(yōu)點：反應(yīng)可自動化，定量定性、重現(xiàn)性優(yōu)異。由于反應(yīng)前試樣成分在柱中分離，“雜質(zhì)”被去除，比較穩(wěn)定。,9,柱前衍生法： 將各種氨基酸和熒光試劑先作用生成衍生物，再分離，直接檢測衍生物的熒光。特點：反應(yīng)系統(tǒng)小，試劑用量少?？墒褂酶邇r格的試劑，低背景，可提高靈敏度。即使檢測出未反應(yīng)試劑，但經(jīng)柱分離，也不會影響檢測。,10

6、,氨基酸水解方法：通常是5.7mol/L HCl真空狀況下110℃水解24h，也有在150 ℃下快速水解4h。不同條件下，各種氨基酸的回收有所不同，且有的氨基酸會遭受破壞（如色氨酸）。保證氨基酸分析準確性的方法：過去用胰島素為標準樣品來判斷，近年來采用“測試肽法”，即將20種常見氨基酸人工合成一個20肽。然后水解，每種氨基酸殘基出現(xiàn)頻率是1，易于校正回收。,11,新的方法：毛細管電泳，僅需ng的量，分辨率和準確性均比SDS-

7、PAGE好。質(zhì)譜，靈敏度和準確性都很好，精確度達0.01%。,12,13,三、蛋白質(zhì)分子量的測定,早期方法：超離心、光散射法，需較高級儀器和較多的樣品，現(xiàn)很少使用。凝膠過濾法測蛋白質(zhì)分子量。如Sephadex系列（G75、G100）等——HPLC凝膠過濾系統(tǒng)。測定是完整蛋白質(zhì)分子量。實驗室常規(guī)方法：SDS-PAGE，用量約1ug，誤差為5-10%，但方便。測定蛋白質(zhì)亞基的分子量。,14,毛細管等電聚焦電泳-電噴霧質(zhì)譜技術(shù)（CIEF

8、-MS）：分辨率極高，能分辨的等電點差異小于0.04pH。一些標準樣品用此法分析可發(fā)現(xiàn)亞型（分子量完全一樣，等電點不同）的存在。如細胞色素C兩個亞型分別為9.60、9.55。一般的方法根本無法分辨。,15,四、蛋白質(zhì)的等電點,等電聚焦法：可以測定蛋白質(zhì)的等電點，同時可鑒定蛋白的純度。毛細管等電聚焦法：能測定偏堿性的蛋白質(zhì)的等電點，如天花粉蛋白的等電點測定。,16,五、肽譜,肽譜技術(shù)：是指蛋白質(zhì)被酶解或化學降解后肽段的分離分析或制備

9、。1、裂解方法：用酶或化學法裂解蛋白質(zhì)成肽段。 酶解：胰蛋白酶（切堿性氨基酸如Arg,lys的C端）Lys-C內(nèi)肽酶只作用于Lys-X鍵；梭菌蛋白酶只作用于Arg-X鍵。V8蛋白質(zhì)只專一作用于負電性氨基的C端（Glu,Asp）；在pH=4條件下，V8只作用于Glu-X鍵。,17,化學裂解：最常用的是溴化氰，作用于Met C端和其次一個AA的肽鍵。如γ-干擾素有4個Met，可被裂解成5肽段。BNPS-3甲基吲哚、N-氯代琥

10、珀酰亞胺作用于Trp-X鍵上；2-硝基-5硫氰基苯甲酸作用在X-Cys鍵上；羥胺作用在Asn-Gly鍵上。,18,,2、肽譜分析肽譜分析一般用HPLC和CE來進行：HPLC主要是用RP-HPLC根據(jù)肽的長短和疏水性來分離。當肽親水性強，用HPLC不能帶留在柱內(nèi)，達不到分辨效果；或當肽疏水性很強，粘在柱上洗不下來時，可用CE來進行。SDS-PAGE：當裂解成的肽段較大時，可進行。當對于小分子肽時，往往無法分辨。質(zhì)譜分析蛋白

11、質(zhì)的酶解產(chǎn)物，多肽出現(xiàn)先后按分子量大小排列。,19,六、蛋白質(zhì)突變點的分析,例子：人白細胞介素-2的突變點分析。133AA，第125是一游離Cys，第58位和第105位半胱氨酸形成二硫鍵（活性必需）。鑒定IL-2的蛋白質(zhì)工程(Cys-Ser/Ala)突變點：用TPCK-胰蛋白酶水解后，進行RP-HPLC分離分析。天然IL-2和新型IL-2的酶解圖譜比較尋找有差別的肽進行順序分析；熒光標記Cys殘基，比較標記前后新型IL-2酶解圖譜

12、的差別，從而鑒別出點突變的肽；同位素標記法；利用IL-2只有一個色氨基酸，280nm主要是色AA吸收其次是酪AA和苯丙氨酸，酶解后分別用214nm和280nm檢測，可找到含色AA的肽段——用CE確定為均一——AA序列分析——證實新型IL-2的Ser（125）取代了Cys。,20,酶解后，用液質(zhì)分析，尋找與理論值分子量不一致的肽段。,21,新的方法：CE-MS聯(lián)機來檢測IL-2突變點，更快速和準確。,22,七、蛋白質(zhì)的二硫鍵分析,二硫

13、鍵的錯配，生物活性只有原來的1/400。分析方法：IL-2（3個Cys）：用同位素標記，pH=8.5用3H-碘代乙酸處理IL-2，只有游離的巰基才與其作用，然后還原，再用14C-碘代乙酸烷化。故如3H-標記僅在肽11上，14C-的放射性全在肽12和肽14上，則和天然結(jié)構(gòu)是一致的。SOD（3個Cys）:可用同樣的方法。直接分析二硫鍵的異構(gòu)物。IL-2在堿性條件下形成二硫異構(gòu)體（58與125位或105與125形成二硫鍵），反相色譜中