1、隨著工業(yè)的發(fā)展和人口的增加，資源短缺和環(huán)境污染成為困擾人類發(fā)展的兩個重要難題。進入新世紀以來化石資源日益枯竭，開發(fā)清潔的的可再生能源已成為人們的迫切需要。以纖維素為主要成分的生物質(zhì)資源是地球上含量最豐富的可再生資源，對纖維素資源的開發(fā)利用越來越受到人們的重視。但由于纖維素結(jié)構(gòu)致密、不溶于水、本身存在結(jié)晶區(qū)等原因，纖維素的生物轉(zhuǎn)化效率很低。因此研究纖維素的生物降解途徑，提高生物轉(zhuǎn)化的效率是纖維素資源利用的前提條件。
　　Cytoph

2、aga hutchinsonii是擬桿菌門（Bacteroidetes）一種好氧的革蘭氏陰性細菌。C.hutchinsonii可以快速徹底地降解結(jié)晶纖維素，但其既不分泌游離的纖維素酶也沒有纖維小體結(jié)構(gòu)，同時纖維素酶系中沒有內(nèi)切纖維素酶存在，纖維素酶也不含有CBM結(jié)構(gòu)。因此C.hutchinsonii的纖維素降解機制不同于已知的好氧微生物游離纖維素酶機制以及厭氧微生物的纖維小體降解機制，可能是一種全新且未知的降解機制。對這種高效的結(jié)晶纖維

3、素降解機制的研究有助于提高人們對纖維素降解機制的認識，并對纖維素生物轉(zhuǎn)化利用提供幫助。之前由于C.hutchinsonii遺傳操作體系的不成熟，對其纖維素降解機制研究進展十分緩慢。近年來C.hutchinsonii遺傳操作體系的不斷發(fā)展為纖維素降解機制的研究奠定了基礎(chǔ)。纖維二糖是纖維素的結(jié)構(gòu)的基本組成單位，并且纖維二糖還是纖維素降解的重要中間產(chǎn)物。因此探究C.hutchinsonii對纖維二糖的降解及利用過程對C.hutchinsoni

4、i纖維素降解機制的研究有重要意義。本文通過基因敲除等手段探究C.hutchinsonii的四個β-葡萄糖苷酶各自的功能及其在纖維素降解中作用。同時利用離子色譜手段對纖維寡糖和纖維素降解過程的中間產(chǎn)物進行檢測，以期望可以探尋C.hutchinsonii纖維素的降解途徑。采用新的吸附蛋白提取方法鑒定出一批C.hutchinsonii的吸附蛋白，研究了纖維素誘導吸附蛋白CHU_0344的功能。同時利用轉(zhuǎn)座子插入突變方法篩選到一株色素缺失菌株，

5、研究了flexirubin色素多烯鏈合成中關(guān)鍵β-羥酰-ACP脫水酶的作用以及flexirubin色素的生物學功能。具體內(nèi)容及結(jié)果如下:
　　1.C.hutchinsoniiβ-葡萄糖苷酶功能及其對纖維素降解的影響，C.hutchinsonii纖維素降解產(chǎn)物檢測及其雙途經(jīng)降解體系。
　　我們研究了C.hutchinsoniiβ-葡萄糖苷酶的功能，及其在纖維素降解中的作用。同時首次研究發(fā)現(xiàn)C.hutchinsonii存在細胞表

6、面纖維素降解途徑，并證實C.hutchinsonii存在細胞內(nèi)降解途徑，從而提出新的雙途徑降解模型。
　　β-葡萄糖苷酶在纖維素降解過程中主要起到降解中間產(chǎn)物纖維二糖的作用。同時有部分β-葡萄糖苷酶具有轉(zhuǎn)糖基作用。C.hutchinsonii經(jīng)過基因組分析預測發(fā)現(xiàn)有四個β-葡萄糖苷酶基因:bglA(chu_2268)、bglB(chu_2273)、bglC(chu_3577)和bglD(chu_3784)。所有的四個β-葡萄糖苷酶

7、都屬于糖苷水解酶GH3家族，其中BglA，BglB，BglC被預測為脂蛋白。通過SignalP4.1預測發(fā)現(xiàn)只有BglB含有信號肽，但是BglA，BglC和BglD蛋白的前30位氨基酸均含有大量的疏水性氨基酸，因此推測在這些蛋白中同樣含有信號肽。
　　為研究四個β-葡萄糖苷酶在纖維二糖和纖維素降解中各自起的作用，首先檢測野生菌株中在不同培養(yǎng)條件下四個酶在RNA水平和蛋白水平的表達情況。通過熒光定量PCR和蛋白活性電泳檢測，發(fā)現(xiàn)在葡

8、萄糖培養(yǎng)條件下只有bglB基因存在表達。在纖維二糖或纖維素培養(yǎng)條件下BglA和BglB都存在表達，但BglA的表達水平遠低于BglB。BglC的兩種條件下表達水平都很低，而BglD現(xiàn)有的實驗條件下檢測不到表達。因此我們推測BglA和BglB在C.hutchinsonii纖維二糖和纖維素降解中期關(guān)鍵作用。
　　隨后我們通過同源雙交換重組技術(shù)對四個β-葡萄糖苷酶進行基因敲除，得到單敲除菌株△bglA、△bglB、△bglC和△bglD

9、。同時對主要的β-葡萄糖苷酶進行多敲除得到△bglA△bglB/和△bglA/bglB/bglC突變株。
　　表型檢測發(fā)現(xiàn)單敲除菌株中只有△bglB在纖維二糖和纖維素培養(yǎng)時存在延遲，其它單敲除菌株不受影響。但雙敲除菌株和三敲除菌株喪失降解纖維二糖和纖維素的能力。酶活檢測發(fā)現(xiàn)在葡萄糖培養(yǎng)條件下單獨敲除bglB后菌體喪失全部β-葡萄糖苷酶酶活，而在纖維素培養(yǎng)條件下敲除bglB后菌體保留20％的酶活，但△bglA/bglB喪失所有酶活，

10、其它單敲除菌株不會影響菌體的β-葡萄糖苷酶酶活。同時檢測菌體的纖維二糖降解能力，發(fā)現(xiàn)△bglB在降解纖維二糖時存在延遲并且降解速率明顯降低，△bglA/bglB完全喪失降解纖維二糖的能力。所有結(jié)果表明BglB在C.hutchinsonii纖維二糖和纖維素降解中起關(guān)鍵作用，BglA可以被誘導產(chǎn)生從而部分彌補△bglB中β-葡萄糖苷酶缺失帶來的影響。
　　在纖維素降解方面，所有單敲除菌株均可以降解纖維素，△bglA/bglB無法在液體

11、條件下降解纖維素，但是在固體平板上可以降解濾紙。通過研究發(fā)現(xiàn)固體平板中的少量營養(yǎng)物質(zhì)可以促使△bglA/bglB降解纖維素，并且在液體條件下外加少量葡萄糖時△bglA/bglB可以降解纖維素。但△bglA/bglB缺失β-葡萄糖苷酶活性，在外加葡萄糖條件下仍不能降解纖維二糖。這些結(jié)果表明C.hutchinsonii可以通過不需要β-葡萄糖苷酶參與的途徑降解纖維素。經(jīng)過定量分析發(fā)現(xiàn)當△bglA/bglB在外加少量葡萄糖條件下降解纖維素時，

12、超過55％的纖維素被轉(zhuǎn)化為纖維二糖，其它部分纖維素被菌體轉(zhuǎn)化為葡萄糖供菌體生長。
　　我們基于離子色譜的手段建立了C.hutchinsonii細胞外和細胞內(nèi)纖維寡糖的檢測方法。當野生菌體與纖維二糖共同孵育時，短時間內(nèi)菌體即可將纖維二糖完全轉(zhuǎn)化為葡萄糖并在細胞外大量積累，但在整個過程中細胞體內(nèi)檢測不到纖維二糖和葡萄糖的積累。同時通過酶活測定結(jié)果以及Western blot檢測發(fā)現(xiàn)C.hutchinsonii中β-葡萄糖苷酶既存在于細

13、胞表面又存在于周質(zhì)空間。由此我們推斷外源的纖維二糖在細胞表面降解為葡萄糖后再被菌體利用。
　　長期以來，人們在C.hutchinsonii的發(fā)酵液中沒有檢測到明顯的還原糖。我們通過離子色譜的手段成功的在纖維素培養(yǎng)早期檢測到明顯的葡萄糖積累。另外當野生株菌體與纖維素孵育時，在體外可以檢測到大量的葡萄糖以及少量的纖維二糖和纖維三糖積累。同時細胞表面存在β-葡萄糖苷酶和纖維素內(nèi)切酶，這表明C.hutchinsonii存在細胞表面纖維素降

14、解途徑。
　　我們首次在C.hutchinsonii降解纖維素過程中，于細胞內(nèi)檢測到大量的葡萄糖、纖維二糖以及纖維三糖等纖維素降解產(chǎn)物的積累。研究發(fā)現(xiàn)細胞外纖維寡糖不容易轉(zhuǎn)運到細胞體內(nèi)，這表明細胞內(nèi)降解產(chǎn)物不是由細胞外降解產(chǎn)物轉(zhuǎn)運而來。同時周質(zhì)空間存在β-葡萄糖苷酶和纖維素內(nèi)切酶，這表明C.hutchinsonii存在細胞內(nèi)纖維素降解途徑。
　　根據(jù)本文中研究結(jié)果結(jié)合他人的研究成果，我們提出新的C.hutchinsonii纖

15、維素降解模型:1.C.hutchinsonii既可以在細胞表面降解纖維素也可以在周質(zhì)空間降解纖維素。2.在細胞表面纖維素內(nèi)切酶在其它蛋白幫助下可以將纖維素降解為纖維寡糖，隨后被β-葡萄糖苷酶降解為葡萄糖。3.細胞表面的蛋白可以剝離纖維素鏈并將其轉(zhuǎn)運到周質(zhì)空間，并通過纖維素內(nèi)切酶和β-葡萄糖苷酶降解為葡萄糖4.C.hutchinsonii可以在沒有β-葡萄糖苷酶的參與下部分降解纖維素。在這一部分工作中我們研究了C.hutchinsonii

16、β-葡萄糖苷酶的功能，提出新的雙途徑降解模型。這提高了我們對C.hutchinsonii纖維素降解機制的認識，使C.hutchinsonii纖維素降解研究不再局限于周質(zhì)空間，從而使有利于進一步揭示C.hutchinsonii纖維素降解機制。
　　2.纖維素吸附蛋白的鑒定及吸附蛋白CHU_0344功能的研究
　　C.hutchinsonii獨特的纖維素降解途徑需要菌體直接與纖維素接觸。纖維素吸附蛋白特別是表面吸附蛋白在菌體吸附

17、并降解纖維素過程中起重要作用。本文通過使用Triton X-100抽提破碎細胞釋放蛋白質(zhì)并使其吸附纖維素的方法，得到菌體在葡萄糖和纖維素培養(yǎng)條件下的全細胞的吸附蛋白。經(jīng)過質(zhì)譜鑒定得到781個纖維素培養(yǎng)條件下的吸附蛋白和744個葡萄糖培養(yǎng)條件下的吸附蛋白。通過質(zhì)譜鑒定結(jié)果可以近似比較各蛋白相對的表達量。通過比較發(fā)現(xiàn)有部分蛋白在葡萄糖和纖維素培養(yǎng)條件下存在明顯差異。并且現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的影響纖維素降解的幾個重要蛋白均位于質(zhì)譜結(jié)果的前100位。C.h

18、utchinsonii纖維素吸附蛋白的鑒定為尋找纖維素降解相關(guān)重要蛋白提供了參考。
　　選取表達水平較高并且在纖維素培養(yǎng)條件下存在明顯上調(diào)的CHU_0344蛋白進行研究。前期研究發(fā)現(xiàn)CHU_0344蛋白既可以定位于細胞膜也可以分泌到細胞外。對chu_0344基因進行敲除，發(fā)現(xiàn)敲除株纖維素吸附能力只有野生株的75％左右，并且菌體降解纖維素能力略有降低。這表明CHU_0344蛋白在菌體吸附纖維素過程中起作用，并影響纖維素的降解。

19、>　　3.chu_2110基因功能及flexirubin色素生物學功能研究轉(zhuǎn)座子隨機插入突變技術(shù)是研究功能基因的常用手段。我們通過HimarEm3轉(zhuǎn)座子對C.hutchinsonii進行插入突變，篩選到一株色素合成缺陷菌株。通過反向PCR檢測發(fā)現(xiàn)插入位點位于chu_2110(fabZ)基因?；匮a基因chu_2110使突變株色素合成表型恢復。fabZ基因編碼一個122氨基酸的蛋白。FabZ蛋白（YP_678715.1）標注為β-羥酰-AC

20、P脫水酶，在蛋白序列的N端有一個FabA_FabZ/hot_dog超家族的保守結(jié)構(gòu)域。通過SignalP4.1預測蛋白沒有信號肽，PSORTb預測蛋白定位于細胞質(zhì)中。β-羥酰-ACP脫水酶通常在Ⅱ型脂肪酸合成的延伸過程中起所用。本文研究發(fā)現(xiàn)β-羥酰-ACP脫水酶FabZ在C.hutchinsoniiflexirubin色素的多烯鏈的合成過程中起作用，在此過程中FabZ催化一個類似脂肪酸合成延伸過程的循環(huán)途徑。
　　在C.hutch

21、insonii中含有兩個β-羥酰-ACP脫水酶:CHU_2110(FabZ)和CHU_0969(FabA)。其中fabZ位于色素合成相關(guān)基因簇中，而fabA位于脂肪酸代謝相關(guān)基因簇。在研究發(fā)現(xiàn)敲除fabA基因不會影響C.hutchinsonii flexirubin色素的合成。同時發(fā)現(xiàn)在已報道的幾種產(chǎn)flexirubin色素菌體的色素合成基因簇中包含的均為fabZ基因。
　　色素是微生物的重要次級代謝產(chǎn)物，flexirubin色素