1、微生物實(shí)驗(yàn)室良好規(guī)范USP Best Practices,August 2016,微生物實(shí)驗(yàn)室良好規(guī)范,無菌技術(shù)培養(yǎng)基管理菌種管理設(shè)備操作與管理認(rèn)真的記錄與數(shù)據(jù)評(píng)估人員培訓(xùn)微生物數(shù)據(jù)天生不確定性，高風(fēng)險(xiǎn)重現(xiàn)性與可靠性取決于采用的方法與操作規(guī)范,培養(yǎng)基管理,培養(yǎng)基配制,優(yōu)質(zhì)培養(yǎng)基取決于制備存儲(chǔ)質(zhì)量控制干粉培養(yǎng)基成品培養(yǎng)基分析證：外購培養(yǎng)基有效期儲(chǔ)存條件質(zhì)控用菌種培養(yǎng)適用檢驗(yàn),培養(yǎng)基配制,水純化水：

2、最佳去離子水或蒸餾水：可用低于此質(zhì)量水：不宜使用必須記錄配制水量稱量準(zhǔn)確天平經(jīng)過校驗(yàn)，稱量范圍適用稱量容器與工具：清潔記錄稱量成份,培養(yǎng)基配制,干粉培養(yǎng)基：應(yīng)充分溶解后再分裝與滅菌不得過分加熱配制用設(shè)備可控制加熱過程：培養(yǎng)基顏色加深（梅拉得反應(yīng)或非酶解褐變反應(yīng)）恒定攪拌混和均勻玻璃容器：清潔充分防止抑菌物：來自于洗滌劑或遺留物質(zhì)用純化水充分沖洗洗滌劑,培養(yǎng)基滅菌,按供應(yīng)商建議或經(jīng)過驗(yàn)證商業(yè)化培養(yǎng)供應(yīng)商

3、提供滅菌方法優(yōu)先濕熱滅菌：熱敏感成分除外無菌過濾滅菌方法與條件：驗(yàn)證無菌驗(yàn)證促生長實(shí)驗(yàn)濕熱滅菌驗(yàn)證：121C/15min熱分布裝載方式與裝置量裝載量過多：滅菌時(shí)間可以延長滅菌柜升溫過慢：培養(yǎng)基會(huì)過熱,培養(yǎng)基滅菌,滅菌冷卻后，應(yīng)立即取出培養(yǎng)基否則培養(yǎng)基會(huì)過熱滅菌不當(dāng)：培養(yǎng)基變色培養(yǎng)基變混膠體粘性改變pH改變促生長實(shí)驗(yàn)結(jié)果變小生長選擇性變差,培養(yǎng)基滅菌,滅菌后pH測定冷卻至室溫20-25C測定pH：無

4、菌取樣外購冷藏培養(yǎng)基：測定pH之前應(yīng)加熱至室溫扁平pH探頭：瓊脂表面浸入式探頭：液體培養(yǎng)基pH認(rèn)可范圍：與廠家標(biāo)定值比較：±0.2,培養(yǎng)基儲(chǔ)存,供應(yīng)商發(fā)貨前：貯存與運(yùn)輸方式全過程不得影響培養(yǎng)基水份控制溫度防止微生物污染機(jī)械保護(hù)培養(yǎng)基標(biāo)識(shí)批號(hào)制備日期有效期名稱,培養(yǎng)基儲(chǔ)存,供應(yīng)商建議自行配制培養(yǎng)基：驗(yàn)證后的儲(chǔ)存條件不得0℃或低于0℃儲(chǔ)存）冷凍會(huì)破壞培養(yǎng)基膠體結(jié)構(gòu)避光、密閉、避免水份流失,培養(yǎng)基溶解

5、,只允許一次避免過熱與污染水浴加熱或自由流動(dòng)蒸汽（無壓力）微波爐或加熱板：使用時(shí)避免過熱注意安全熔化的瓊脂培養(yǎng)基：水溫45-50 ℃, 不超過8小時(shí)培養(yǎng)基分裝：水浴水不得流入分裝容器,培養(yǎng)基質(zhì)量檢查,質(zhì)量影響因素原始成份來源差異：天然產(chǎn)品批與批之間一致性制備過程儲(chǔ)存條件影響結(jié)果微生物生長情況回收率結(jié)果不可靠,培養(yǎng)基質(zhì)量檢查,自制培養(yǎng)基pH促生長實(shí)驗(yàn)制備與滅菌驗(yàn)證之后：可只對(duì)進(jìn)廠干粉否則每批做抑菌

6、性特性檢查定期穩(wěn)定性檢查：確認(rèn)有效期促生長實(shí)驗(yàn)用檢定菌藥典要求供應(yīng)商指定環(huán)境分離菌 (非藥典要求）,培養(yǎng)基質(zhì)量檢查,容器或蓋子是否有裂紋裝量不均勻脫水導(dǎo)致固體培養(yǎng)基表面皴裂或凹陷溶血現(xiàn)象顏色過深或變色冷凍后形成結(jié)晶微生物污染氧化還原指示劑狀況 (redox indicator)批號(hào)與有效期檢查，做出記錄無菌性平板清潔狀況 (蓋子不得粘附于平板）,培養(yǎng)基質(zhì)量檢查,有效期：促生長實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持有效期結(jié)束時(shí)與

7、培養(yǎng)基成分、配方、保存容器類型相關(guān)促生長實(shí)驗(yàn)失敗調(diào)查與整改同時(shí)出現(xiàn)的陽性結(jié)果：陽性結(jié)果不可認(rèn)定為無效,菌種鑒別試劑,類別，如革蘭氏染色劑氧化酶實(shí)驗(yàn)試劑質(zhì)量檢查選擇正確標(biāo)準(zhǔn)菌生產(chǎn)廠家建議使用前質(zhì)量檢查,無菌檢驗(yàn)與無菌環(huán)境監(jiān)測培養(yǎng)基,雙層包裝最終滅菌若非最終滅菌，使用前必須100%預(yù)培養(yǎng)預(yù)培養(yǎng)之后：必須促生長實(shí)驗(yàn)防止關(guān)鍵區(qū)域污染防止假陽性結(jié)果接觸碟：必須檢查瓊脂培養(yǎng)基是否有突起,菌種管理,菌種管理,使用與儲(chǔ)存

8、：一致性菌種來源國家菌種中心或有資質(zhì)的供應(yīng)商冷凍、凍干、斜面或即時(shí)使用型菌種鑒別與純度：使用前確認(rèn)即時(shí)使用型：使用前進(jìn)行純度與鑒別檢查至種和屬,菌種管理,菌種制備與復(fù)蘇供應(yīng)商建議驗(yàn)證的成熟方法儲(chǔ)存原始菌種：使用批號(hào)技術(shù)國家菌種中心或合格供應(yīng)商菌種原始菌種首次傳代：在低溫保護(hù)培養(yǎng)基中制備懸液，轉(zhuǎn)移至試管，在-30 ℃以下保存，供下次使用。若-70C或凍干保存，菌種可長期保存。每月從冷凍管制備工作菌懸液；打開使

9、用后的冷凍管：銷毀，避免失活或污染,菌種管理,工作控制菌的傳代次數(shù)：transfer可追蹤過度傳代：增加表形變化或變異的風(fēng)險(xiǎn)應(yīng)具體規(guī)定次數(shù) subculture傳代的定義 passage將存活菌種轉(zhuǎn)移至新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)生長任何形式的移植培養(yǎng)subculture都認(rèn)定為傳代transfer / passage,實(shí)驗(yàn)室設(shè)備,微生物實(shí)驗(yàn)室設(shè)備,培養(yǎng)箱水浴滅菌柜必須進(jìn)行正式驗(yàn)證、定期校驗(yàn)（每年）新設(shè)備、關(guān)鍵操作設(shè)備根據(jù)Q

10、A批準(zhǔn)的方案進(jìn)行確認(rèn)日常清潔：培養(yǎng)箱、冰箱、水浴減少微生物污染培養(yǎng)箱與冰箱門密封條清潔與檢查,微生物實(shí)驗(yàn)室設(shè)備,pH計(jì)、分光光度計(jì)定期校驗(yàn)日常檢查無法消毒的設(shè)備：冰箱、培養(yǎng)箱無菌操作設(shè)立專用冰箱或培養(yǎng)箱無菌培養(yǎng)基儲(chǔ)存專用無菌樣品培養(yǎng)專用菌種操作與處理專用,微生物實(shí)驗(yàn)室設(shè)備,滅菌柜驗(yàn)證與確認(rèn)滅活專用,布局與操作,微生物實(shí)驗(yàn)室布局與操作,分區(qū)潔凈區(qū)(無菌區(qū))有菌區(qū)環(huán)境監(jiān)測樣或無菌產(chǎn)品樣品處理與培養(yǎng)區(qū)不得有

11、存活微生物：盡可能至少應(yīng)有物理隔離無菌衣消毒過程僅用于潔凈或無菌操作的生物安全柜建立泄漏或事故處理程序所有相關(guān)人員培訓(xùn),微生物實(shí)驗(yàn)室布局與操作,樣品長菌需要進(jìn)一步分析鑒別立即移出潔凈區(qū)有菌區(qū)分離、染色、微生物鑒別、調(diào)查只能在有菌區(qū)進(jìn)行有微生物生長的任何樣品不得在潔凈區(qū)打開避免假陽性,,微生物實(shí)驗(yàn)室布局與操作,取樣人員：不得進(jìn)入菌種操作區(qū)若需進(jìn)入 ：必須穿戴防護(hù)服、手套、退出時(shí)仔細(xì)消毒盡量不在實(shí)驗(yàn)室菌

12、種操作區(qū)域附近工作樣品污染：隨時(shí)可能發(fā)生，造成假陽性結(jié)果原材料、輔料取樣：控制環(huán)境中適當(dāng)著裝、滅菌取樣工具公用系統(tǒng)取樣：如，水，無菌取樣方式,微生物實(shí)驗(yàn)室布局與操作,環(huán)境監(jiān)測取樣儀器設(shè)備的擺放與移除對(duì)無菌操作要求較低設(shè)備儀器應(yīng)同時(shí)與微生物培養(yǎng)基同時(shí)擺放各類無菌檢驗(yàn)：應(yīng)在控制環(huán)境中進(jìn)行無菌制劑原料藥發(fā)酵菌種生物制品菌種隔離器 ,樣品操作,樣品操作,操作與儲(chǔ)存條件：關(guān)鍵微生物樣品：水、環(huán)境監(jiān)測樣、生物負(fù)荷樣關(guān)鍵

13、參數(shù)：樣品成分包材成份儲(chǔ)存時(shí)間儲(chǔ)存溫度取樣操作至檢驗(yàn)開始的時(shí)間嚴(yán)格控制期間的儲(chǔ)存條件樣品轉(zhuǎn)移到較遠(yuǎn)處檢測運(yùn)輸條件確認(rèn)：時(shí)間、溫度等USP 醫(yī)藥用水,樣品操作,取樣前樣品混和：必須評(píng)估與確認(rèn)確保樣品代表性微生物分布微生物樣品取樣操作：無菌取樣技術(shù)取樣區(qū)域：無菌取樣區(qū)取樣區(qū)域盡可能接近取樣點(diǎn)減少樣品運(yùn)輸途中污染,培養(yǎng)時(shí)間,微生物培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí)間,培養(yǎng)時(shí)間的表達(dá)：若小于3天，應(yīng)準(zhǔn)確到小時(shí)，30-35℃,

14、 18-72hrs至少培養(yǎng)至?xí)r長下限，超出時(shí)間進(jìn)行評(píng)估檢驗(yàn)時(shí)間大于72小時(shí)，按天表達(dá)30-35℃, 3 – 5天上午或下午開始培養(yǎng)，也應(yīng)同樣時(shí)間結(jié)束,人員培訓(xùn),人員培訓(xùn),微生物學(xué)教育背景員工主管經(jīng)理職責(zé)明確操作規(guī)程的培訓(xùn)檢驗(yàn)方法描述文件編號(hào)便于檢索化驗(yàn)員接受的培訓(xùn)內(nèi)容建立個(gè)人培訓(xùn)檔案確認(rèn)后方能獨(dú)立操作培訓(xùn)記錄時(shí)效性：現(xiàn)行版本與SOP,人員培訓(xùn),化驗(yàn)員定期技能(核心操作)評(píng)估：衛(wèi)生制備雙碟無菌操作記錄

15、主管或經(jīng)理檢驗(yàn)操作水平至少等同于其下級(jí)化驗(yàn)員主管技能實(shí)驗(yàn)室安全計(jì)劃預(yù)算調(diào)查技術(shù)技術(shù)報(bào)告編寫SOP編寫，等,人員培訓(xùn),能力證明課程教育相關(guān)經(jīng)驗(yàn)繼續(xù)教育培訓(xùn)證書主管能力微生物知識(shí)與技能學(xué)院課程教育培訓(xùn)證書,人員培訓(xùn),公司管理層責(zé)任：確保微生物檢驗(yàn)負(fù)責(zé)人理解微生物學(xué)基本原則有良好知識(shí)與能力解釋并掌握法律法規(guī)與員工有良好溝通能力，在理論與實(shí)際操作上指導(dǎo)化驗(yàn)員微生物學(xué)工作的嚴(yán)謹(jǐn)性、科學(xué)性與化學(xué)分析、工程

16、技術(shù)不同沒有特殊的人員無法從事此項(xiàng)工作,資源,實(shí)驗(yàn)室資源,實(shí)驗(yàn)室管理人員的職責(zé)實(shí)驗(yàn)室能力評(píng)估要素調(diào)查的案例數(shù)時(shí)間：樣品接收至開始檢驗(yàn)時(shí)間：檢驗(yàn)結(jié)束至開具報(bào)告上述時(shí)間過長實(shí)驗(yàn)室資源與人員不足預(yù)算充足可靠檢驗(yàn)結(jié)果的保證,記錄,記錄管理 － 受控的證據(jù),化驗(yàn)員培訓(xùn)與能力證明設(shè)備驗(yàn)證、校驗(yàn)與維護(hù)檢驗(yàn)過程中設(shè)備性能 (24小時(shí)/7天記錄)培養(yǎng)基制備、無菌檢查、促生長實(shí)驗(yàn)、選擇能力培養(yǎng)基庫存與質(zhì)量檢驗(yàn)操作程序規(guī)定的關(guān)鍵操

17、作數(shù)據(jù)與計(jì)算核實(shí)QA或授權(quán)經(jīng)理審核報(bào)告數(shù)據(jù)偏差調(diào)查,化驗(yàn)室記錄的維護(hù),化驗(yàn)室記錄應(yīng)包括的要素日期樣品名稱化驗(yàn)員姓名規(guī)程號(hào)記錄檢驗(yàn)結(jié)果偏差參數(shù)記錄設(shè)備、微生物菌種、培養(yǎng)基批號(hào)主管/復(fù)核人簽名,化驗(yàn)室記錄的維護(hù),記錄關(guān)鍵設(shè)備，按期校驗(yàn)、有維保記錄、使用日志設(shè)備溫度（水浴、培養(yǎng)箱、滅菌柜），可追溯SOPSOP名稱與版本號(hào)方法描述應(yīng)具體詳細(xì)書寫修改：單線劃掉，簽字、日期原數(shù)據(jù)不得擦掉、或涂抹檢驗(yàn)結(jié)果原

18、始平板計(jì)數(shù)：便于復(fù)核圖表：裝訂應(yīng)安全、數(shù)據(jù)可讀；騎縫簽字,化驗(yàn)室記錄的維護(hù),筆記本頁碼目錄索引（SOP與執(zhí)行文件號(hào)）使用期限記錄保存正式文件規(guī)定各類記錄保存期限,檢驗(yàn)結(jié)果,微生物結(jié)果表達(dá)與解釋,檢驗(yàn)結(jié)果與預(yù)期明顯不同：并不重要，因?yàn)楦黝愖匀唤缙毡榇嬖诘木彩浅Ｒ姯h(huán)境污染菌取樣與處理樣品過程：化驗(yàn)員可能帶入污染樣品或環(huán)境微生物菌分布不均勻微生物結(jié)果變化性大檢驗(yàn)操作尤其重要微生物結(jié)果來源可能的污染 藥品、輔料

19、或檢驗(yàn)環(huán)境 （如絲狀真菌）,微生物結(jié)果表達(dá)與解釋,出現(xiàn)不符合標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果時(shí)偏差調(diào)查實(shí)驗(yàn)差錯(cuò)實(shí)驗(yàn)環(huán)境污染產(chǎn)品微生物限度超標(biāo)應(yīng)立即通知實(shí)驗(yàn)室主管和QA,微生物結(jié)果超標(biāo)調(diào)查,微生物實(shí)驗(yàn)室條件徹底調(diào)查所有與微生物相關(guān)條件和因素實(shí)驗(yàn)室環(huán)境樣品保存條件歷史結(jié)果樣品特性：微生物存活或繁殖程度與標(biāo)準(zhǔn)限度相差程度超標(biāo)結(jié)果變化性：此項(xiàng)超標(biāo)是否顯著訪談化驗(yàn)員,無菌檢驗(yàn)與無菌環(huán)境監(jiān)測培養(yǎng)基,雙層包裝最終滅菌若非最終滅菌，使用前必須10