1、胃癌患者胃液中特異性熒光物質初步確定,研究背景,1990年, 我中心開始致力于通過檢測血清和胃液的熒光光譜來診斷胃癌的系列研究。先后利用288 nm 紫外光作為激發(fā)光, 對500例各種胃內疾患患者的胃液進行高效液相熒光光譜檢測, 發(fā)現(xiàn)胃癌患者胃液中存在兩種特異性熒光物質, 其含量較胃內良性病變明顯增多。,研究背景,在上述實驗的基礎上, 我們試圖通過聯(lián)合使用高效液相及質譜技術分析高效液相熒光光譜中保留時間為11 .5 ～12 .5 min

2、 的熒光物質成分, 從而對良惡性胃病患者胃液高效液相熒光光譜差異的物質進行初步分析。,研究目的,從胃癌患者胃液中發(fā)現(xiàn)特異性熒光物質 ,并以此來獲得腫瘤標志物。,研究方法,收集 10例胃癌患者與 10例非胃癌患者的胃液 ,濃縮后行高效液相分析 , 并收集高效液相熒光光譜中保留時間為 11.5～ 12 .5min的熒光物質 ; 再經質譜鑒定 , 所得結果與L-色氨酸的質譜比較 , 最終確定這種熒光物質的主要組分。,研究結果,在高效液相

3、的熒光光譜保留時間為 11.5～ 12 .5min時 , 胃癌患者胃液中有特異性熒光物質 ,其含量較其他胃內良性病變患者明顯增多。,胃良、惡性病變患者濃縮胃液的高效液相熒光光譜,,,,研究結果,空白對照的一級質譜圖中有共同質荷比為279及288 的峰;10 例胃癌患者的一級質譜圖中, 均出現(xiàn)質荷比為205 , 217 , 279 , 288 , 404 , 790 及811 的峰, 有些還出現(xiàn)409。而10 例胃內良性病變患者的一

4、級質譜圖中, 均出現(xiàn)質荷比為279 , 404 ,790 及811 的峰。,胃良、惡性病變患者胃液熒光峰收集樣品的一級質譜圖,217,205,,,研究結果,推測胃癌患者胃液中含量較多的特殊熒光物質可能對應的是質荷比為205 及217 的峰。經質譜鑒定后顯示 ,胃癌患者胃液中質荷比為 205的物質與L-色氨酸的三級質譜完全一致 , 證實該物質為L-色氨酸（L-tryptophan）。,討論,近年來經大量研究證實, 機體內存在許多內源性

5、熒光物質, 它們形成的綜合熒光光譜, 在良性病變及腫瘤患者之間確實存在差異。而體液是腫瘤發(fā)生、演進及轉移的內環(huán)境, 腫瘤生長過程中分泌及代謝產物會直接影響體液的組成。對體液進行熒光檢測, 有可能發(fā)現(xiàn)良惡性之間的差異。,討論,在本實驗條件下, 對應著高效液相保留時間為3 .5 ～ 4 .5 min 及11 .5 ～ 12 .5 min 的兩種物質, 利用高效液相技術, 可以將胃液中保留時間在11 .5 ～ 12 .5 min 的特異性

6、熒光成分分離出來, 減少其他物質的干擾, 并可進一步行質譜分析。,討論,對比實驗中, 從胃癌及胃內良性病變患者的質譜圖發(fā)現(xiàn), 兩者均為混合物。證實在液相保留時間為11 .5 ～ 12 .5 min 的收集物中, 同時存在熒光及無熒光的物質。而胃癌患者獨有質荷比為205 及217的峰。據(jù)此推測, 胃癌患者特異性熒光物質的相對分子質量可能為204 或216 。,討論,L -色氨酸是一種重要的可產生熒光的芳香氨基酸。其相對分子質量為204

7、 .2 , 本實驗證實, 它與胃癌特異性熒光物質之一的保留時間一致。與質荷比為205 物質的一、二及三級質譜的圖形完全一致。可以肯定, L-色氨酸是胃癌患者胃液中特異性熒光物質的組成成分。,討論,質荷比為217 的物質也有可能參與熒光峰的形成。且其二級及三級質譜與L-色氨酸一致。故懷疑它為一種與L-色氨酸相類似的物質, 其實際相對分子質量為216 。但因缺乏與本質譜配套的解析標準譜庫,目前無法進一步搞清其結構。,討論,對質譜圖

8、中其他峰代表的物質, 也還應明確其結構及熒光特性。對高效液相保留時間在3 .5 ～ 4 .5 min 的物質, 尚有待進一步確認。,結論,本實驗嘗試聯(lián)合使用高效液相和質譜技術來分析胃液中一種腫瘤標志物的方法。對新的胃癌腫瘤標志物的發(fā)現(xiàn)起鋪墊作用, 具有廣泛的應用前景。對揭示腫瘤發(fā)生、演進及代謝的生化過程有可能起關鍵作用。,李淵,林三仁,周麗雅,彭嘉柔,郭慧蘭. 胃癌患者胃液中特異性熒光物質的初步確定[J]. 中華消化雜志,2003

9、,01:11-14.,,,,,Three aromatic amino acids in gastric juice as potential biomarkers for gastric malignancies,BACKGROUND,For screening early-stage gastric malignancies, the existing

10、serum biomarkers have limited sensitivity and specificity. Gastric juice biomarkers are scarce and require further investigation.,研究背景,對于篩查早期胃惡性腫瘤，現(xiàn)存的血清學生物標志物在敏感性和特異性方面都有其局限性。胃液生物標志物稀缺，需要進一步調查。,OBJECTIVE,We d

11、ivided this study on searching potential biomarkers into four parts: (1) detection of differential spectroscopy and HPLC, (2) identification and validation of differential peaks using LC/MS and NMR, (3) quantification of

12、 potential biomarkers, and (4) establishment of diagnostic detection.,研究目的,我們將這個篩選潛在的生物標記物的研究分為四個部分：（1）聯(lián)合使用熒光光譜和高效液相色譜法檢測良惡性胃病患者胃液熒光光譜；（2）使用液相/質譜和核磁共振的方法來識別和驗證良惡性胃病患者胃液熒光光譜的區(qū)別；（3）定量研究潛在的生物標記物；（4）建立診斷檢測。,METHODS,In this s

13、tudy, discriminating fluorescence biomarkers were isolated and identified from gastric juice by using high-performance liquid chromatography (HPLC) and liquid chromatography/mass spectrometry (LC/MS), and validated using

14、 nuclear magnetic resonance (NMR).,研究方法,本研究中應用高效液相 (HPLC) ，液相/質譜（LC/MS）的方法，分離并識別差異的胃液熒光標志物，并且用核磁共振（NMR）的方法進行了驗證。,RESULTS,The fluorescence spectroscopy of diluted gastric juice indicates that the FI of P1 from patients wi

15、th gastric malignancies was significantly different from that in patients with benign gastric lesions (Fig. 1a and b).,研究結果,稀釋胃液固有熒光光譜表明，胃惡性腫瘤患者FIP1與胃良性病變者明顯不同（圖1A，B）。,Fig. 1. Discovery of fluorescence biomarkers. 圖1 熒

16、光標志物的發(fā)現(xiàn)Fluorescence emission spectra (excitation at 288 nm) of diluted gastric juice from the benign (a) and malignant (b) groups.稀釋胃液的熒光激發(fā)光譜(激發(fā)光波長為288納米)，良性(a)和惡性(b)組。,,,,,RESULTS,HPLC was used for the discovery of va

17、luable biomarkers in the gastric juice. The chromatograms are shown in Fig. 1c–f. By comparing the chromatograms for the benign and malignant groups, the discriminating biomarkers could be associated with peaks I, II,

18、III and IV, which were eluted around 8, 12, 16.5 and 33 min, respectively.,研究結果,采用高效液相色譜法測定胃液中有價值的生物標志物。色譜圖如圖1c–f所示。對良性組和惡性組色譜圖進行比較，有助于鑒別I，II，III和IV相關峰的生物標志物，它們的洗脫時間分別約為8，12，16.5和33分鐘。,Fig. 1. Discovery of fluorescence

19、biomarkers. 圖1 熒光標志物的發(fā)現(xiàn)Fluorescence chromatograms (λ ex = 288 nm, λ em = 360 nm) of gastric juice from benign (c) and malignant (d) groups. 稀釋胃液的熒光質譜圖(激發(fā)光波長為288納米，發(fā)射光波長為360納米)，良性(c)和惡性(d)組。,,,,,Fig. 1. Discovery of f

20、luorescence biomarkers. 圖1 熒光標志物的發(fā)現(xiàn)UV chromatograms (λ = 205 nm) of gastric juice from benign (e) and malignant (f) groups.稀釋胃液的紫外質譜圖(激發(fā)光波長為205納米)，良性(e)和惡性(f)組。,,,,,,,,,,,,,,RESULTS,The fluorescence intensity (FI), t

21、yrosine, phenylalanine, tryptophan and total protein content were significantly higher in the gastric juice of patients with gastric malignancies (all P<0.01).,研究結果,胃惡性腫瘤患者胃液中酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸的熒光強度(FI)和血清總蛋白

22、含量明顯高于胃良性病變患者 (P值均<0.01)。,Fig. 2. (a) Scatter plot indicates values of tyrosine, phenylalanine, tryptophan, total protein and FI in gastric juice from benign and malignant groups. 圖2（a）散點圖顯示良性和惡性病變組患者胃液中酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、

23、總蛋白和熒光強度（FI）值。,,,,RESULTS,With all P<0.001, the areas under the receiver operating characteristic curves of the biomarkers were tyrosine, 0.838; phenylalanine, 0.856; and tryptophan, 0.816. At a specificity of 79.4%,

24、the sensitivity for gastric malignancy detection with phenylalanine was 87.9% only.,研究結果,在所有P < 0.001的生物標志物中,受試者工作特征曲線（ROC）下面積分別是: 酪氨酸,0.838;苯丙氨酸,0.856;色氨酸,0.816。在特異性為79.4%時，苯丙氨酸用于胃惡性腫瘤檢測的靈敏度為87.9%。,Fig. 2.

25、 (b) ROC curves for detection of gastric malignancies were plotted with the use of tyrosine (Tyr), phenylalanine (Phe), tryptophan (Trp), protein and FI. 圖2（b）使用酪氨酸(Tyr),苯丙氨酸(Phe),色氨酸(Trp),總蛋白和熒光強度（FI）繪制的受試者工作特征（ROC）曲線用

26、于檢測胃惡性腫瘤。,,,DISCUSSIONS,The elevation of aromatic amino acids in gastric juice may be explained as follows.First, malignant cells are extremely invasive, and they can synthesize and secrete many enzymes (e.g., matrix me

27、talloproteinases, MMP and proteinases) that could degrade the basement membrane and extracellular matrix.,討論,胃液芳香族氨基酸升高的機制如下：首先，惡性細胞的侵襲性極強，它們可以合成并分泌許多酶類（例如，金屬基質蛋白酶 MMP和蛋白酶）降解基底膜和細胞外基質。,DISCUSSIONS,Collagen fibers and el

28、astin contain endogenous fluorophores (aromatic amino acid residues), which have fluorescence properties, and are rich in the basement membrane and the extracellular matrix.Therefore, the elevation of aromatic amino aci

29、ds in gastric juice might be a phenomenon that results from degradation of basement membrane and extracellular matrix.,討論,膠質纖維和彈性蛋白包括內源性熒光物質（氨基酸殘留物），在細胞基底膜和細胞外基質的含量豐富。因此，胃液氨基酸含量的升高可能預示著基底膜和細胞外基質的降解。,DISCUSSIONS,Second,

30、due to increased protein synthesis and rapid growth, more essential amino acids (especially for aromatic amino acids) may be up-regulated in malignant tissue.Some cells show exfoliation or necrosis and release cytoplasm

31、 enriched with essential amino acids, which could enhance the aromatic amino acids levels in gastric juices.,討論,第二，因為惡變組織蛋白質合成增加，生長加快，所以需要上調必須氨基酸（尤其是芳香族氨基酸）的表達。一些脫落或壞死的細胞釋放必需氨基酸含量豐富的細胞基質，可以提高胃液芳香族氨基酸的水平。,DISCUSSIONS,Thi

32、rd, excess reactive oxygen species (ROS) produced during chronic immune activation around tumor tissue may interrupt the conversion of phenylalanine to tyrosine. Hence, the phenylalanine concentration increases.Moreover

33、, amino-acid-metabolizing enzymes (e.g., indoleamine 2,3-dioxygenase and monoamine oxidase) that are expressed aberrantly in malignant cells, may affect the aromatic amino acids levels in gastric juice.,討論,第三，在腫瘤組織周圍發(fā)生的慢

34、性炎性反應過程中產生的過多的活性氧簇（ROS）阻止了苯丙氨酸轉化為酪氨酸。因此，苯丙氨酸的濃度升高。此外，氨基酸代謝酶（例如，吲哚胺2,3-雙加氧酶和單胺氧化酶）在惡性組織細胞中表達異常，可能會影響胃液芳香族氨基酸的水平。,DISCUSSIONS,All the above causes could elevate the concentration of aromatic amino acids in the gastric jui

35、ce of patients with gastric malignancies.,討論,所有上述原因均可以提高胃惡性腫瘤患者胃液中芳香族氨基酸的含量。,CONCLUSIONS,Aromatic amino acids in gastric juices could be used as potential diagnostic biomarkers to screen gastric 

36、malignancies. It is a less-invasive and economical method compared to gastric biopsy.,結論,胃液芳香族氨基酸可以作為潛在的診斷生物標記物用于篩查胃惡性腫瘤。這是一個比胃粘膜活檢侵襲性更小和更經濟的方法。,Deng K, Lin S, Zhou L, et al. Three aromatic amino acids in gas