1、鼠解剖采樣及血清、培養(yǎng)分離檢驗技術(shù),溫州市疾病預防控制中心,一、鼠疫菌概況1.鼠疫菌的發(fā)現(xiàn)：,1894年香港鼠疫大流行時，日本學者北里和法國學者耶爾森同時從尸體的淋巴結(jié)發(fā)現(xiàn)了這種致病菌，同年9月被命名為鼠疫桿菌。,2.鼠疫菌的地位：,鼠疫菌在分類學上屬真細菌目、腸桿菌科、耶爾森氏菌屬（Genus yersinia）。本屬中的細菌除鼠疫桿菌(Yersinia pestis)外，還有假結(jié)核桿菌（Yersinia Pseudotuterc

2、ulosis）和小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌（Yersinia enterocolitica）。,鼠疫桿菌的生物學特性,1.形態(tài)和染色典型的鼠疫桿菌短而粗、兩極濃染、兩端鈍園、中間澎大， 幾乎成卵園或橢園形，菌體長約1.5～1.8微米，寬0.5～0.7微米。有莢膜、無鞭毛、無芽胞。革蘭氏染色陰性。但鼠疫菌形態(tài)表現(xiàn)上具有明顯的多形性變化，即形態(tài)很不一致，如卵球型或長短不一的長桿形菌細胞等。,用病人材料，死于鼠疫的人尸和動物尸體的新鮮臟器制備的

3、涂片，可見到兩端鈍園，兩極濃染的典型鼠疫桿菌，呈散在或小堆，偶見鏈狀排列。在陳舊性病灶及腐敗材料中，常見到菌體澎大和著色不良的球形菌影及其他變形的鼠疫桿菌。在壓印標本中，可以看到吞噬細胞內(nèi)外有鼠疫桿菌。此點對于鑒別雜菌污染材料有很大的價值，因為動物死后，污染的雜菌不會被吞噬細胞所吞噬。,培養(yǎng)特性,鼠疫桿菌為需氣，亦為兼性厭氣性的細菌，故非絕對需氣性菌。在氧氣充足時，固然發(fā)育較好。 鼠疫桿菌能在普通培養(yǎng)基上生長發(fā)育。 培養(yǎng)所需溫度在

4、0～45℃之間均可發(fā)育，不過以25～30 ℃之間的溫度來培養(yǎng)發(fā)育較佳,而以28～30℃培養(yǎng)為最好，較37℃時豐盛五倍， 至于在血液瓊脂平板上則以37℃為宜。,培養(yǎng)基的酸堿度在PH5.8～8.0均可發(fā)育，但以6.9～7.1為最適宜。,鼠疫桿菌在普通瓊脂平碟上，經(jīng)過24小時即能形成肉眼可見的薄薄一層淡灰色的微小菌落.直徑0.1～0.2毫米，有光澤、園形、中心稍凸出、 無色。顯微鏡下觀察可見碎玻璃片樣透明幼小菌落。培養(yǎng)48小時后，用顯微鏡觀察

5、時，能很清楚的看見非常透明而不整齊的化邊分布在菌落中心凸出部的周圍。菌落中心部呈顆粒狀，或者甚至呈小丘起伏狀，并呈淡黃色或稍呈黃褐色?；ㄟ厧О咨?，并且?guī)缀跏峭该鞯?。?8～30℃培養(yǎng)時菌落相當干燥，容易用接種環(huán)從瓊脂表面將菌落取下來。,鼠疫菌的營養(yǎng)需求,鼠疫菌是需氧或兼性厭氧的細菌，它在發(fā)育過程中不需要更多的氧，在培養(yǎng)基中添加血液、血紅素或其他還原物質(zhì)，改變培養(yǎng)基中的氧化還原電位以利鼠疫菌的發(fā)育，且血紅素又是合成呼吸酶的材料，有刺激鼠疫

6、菌生長的作用。 近年來不斷發(fā)現(xiàn)鼠疫菌在自然條件和實驗條件下，都能發(fā)生變異而形成營養(yǎng)缺陷型和低營養(yǎng)型，其中又以氨基酸營養(yǎng)缺陷型多見。,鼠疫檢驗常用的培養(yǎng)基,1.基礎(chǔ)培養(yǎng)基 常用的普通營養(yǎng)瓊脂、胰酶消化液瓊脂(即赫金格爾瓊脂)，其中以胰酶消化液瓊脂為優(yōu)。目前，國內(nèi)青海省地方病防治所有商品化的干粉可供選擇。2.敏感培養(yǎng)基 所謂敏感培養(yǎng)基，就是在基礎(chǔ)培養(yǎng)基內(nèi)，加入某種鼠疫菌生長刺激劑而成的培養(yǎng)基。最常用的刺激劑有亞硫酸鈉和血

7、液。亞硫酸鈉一般多預先配成2.5％的水溶液，臨用時按每100毫升基礎(chǔ)培養(yǎng)基加入1 毫升使培養(yǎng)基內(nèi)亞硫酸鈉的含量達到0.025％既可；血液一般習慣用家兔溶解血， 但以脫纖維兔溶解血更佳，用量以培養(yǎng)基內(nèi)含量達0.1--1％為合宜，于培基滅菌后冷至45℃左右時加入，混勻后傾注平皿。,3.選擇培養(yǎng)基 為了在腐敗材料中分離出鼠疫菌，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基內(nèi)，加入某種能抑制雜菌生長，但又無害于鼠疫菌生長的物質(zhì)而制成的培養(yǎng)基稱之為選擇培養(yǎng)基。常用的是含

8、1/10萬--1/20萬的龍膽紫或結(jié)晶紫的培養(yǎng)基它能壓制變形菌的繁殖及一般腐敗菌的發(fā)育，尤其是在抑制革蘭氏陽性細菌的生長上有一定的作用，而鼠疫菌在該培養(yǎng)基上24小時后仍可看到完整的菌落。 4.選擇敏感培養(yǎng)基 在優(yōu)質(zhì)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基內(nèi)，同時加入能刺激鼠疫菌生長的刺激劑及抑制其他雜菌生長的物質(zhì)之培養(yǎng)基稱為選擇敏感培養(yǎng)基。這一類培養(yǎng)基是鼠疫細菌檢驗工作中最常用的，它包括龍膽紫溶解血培養(yǎng)基、龍膽紫亞硫酸鈉培養(yǎng)基。,所謂優(yōu)質(zhì)培養(yǎng)基就是培養(yǎng)基

9、內(nèi)氨基酸的含量豐富而且有鼠疫菌生長所必需的種類，氨基氮含量不能低于50mg％，同時還需要有適當?shù)拇碳笠呔淖钚〗臃N量可以少到10個菌體也能長出菌落來。另一方面培養(yǎng)基酸堿度必需準確，PH6.9～7.1，培養(yǎng)基也要求新鮮潤濕，要有一定的厚度，即要有平皿厚度的1/3 左右。,鼠疫菌的毒素,鼠疫菌毒性物質(zhì)在鼠疫菌的細胞內(nèi)部及莢膜中均可發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)已證明鼠疫菌有兩種毒素，即鼠毒素和內(nèi)毒素。鼠疫菌的毒力和毒力決定子于鼠疫菌毒力多原性的理論，這

10、個概念的實質(zhì)在于鼠疫菌的毒力和某些性狀相關(guān)，毒力是鼠疫菌某些性狀的綜合表現(xiàn)，并把他研究的幾種抗原和特征稱為毒力決定子。,,現(xiàn)已證明的毒力決定子是：V和W毒力抗原(VW)、產(chǎn)生莢膜抗原(FraI)、色素沉著因子(Pgm)、鼠疫桿菌素I(PstI)、血漿凝固因子(F)， 后面三個因子顯然是互相聯(lián)系的。此外，有關(guān)鼠疫菌的毒力決定子還有嘌呤依賴(Pu)、鼠毒素(T)， 過氧化氫酶、五碳醣核酸酶和透明質(zhì)酸酶等。根據(jù)WHO鼠疫專家委員會第四報，

11、普遍被承認的毒力決定子只有四個， 即：Fra1、VW、Pgm、Pst1。,,鼠疫菌的毒力常以最小致死量(MLD) 表示：即能引起實驗動物全部死亡的最小菌量。或用半數(shù)致死量(LD50)表示，即能引起試驗動物半數(shù)死亡的菌量來表示。 鼠疫菌的毒力可分為四種類型：即弱毒菌株、低毒菌株、毒菌株和強毒菌株。,鼠疫菌的抗原結(jié)構(gòu)和血清學特征,鼠疫菌有16種抗原，假性結(jié)核桿菌有13種抗原；在鼠疫菌和假性結(jié)核桿菌的抗原中有11種是兩菌共有的。 1.F1

12、抗原又稱莢膜FI（fraction I）抗原，是一種糖蛋白，分子量20000～500000，它至少可以分成4個亞單位，即F1A、F1B、F1Aa、F1Ba（分子量15000～17000）。是鼠疫菌在37℃培養(yǎng)時在菌體周圍生長的一層封套物質(zhì)中的一部分，在37℃培養(yǎng)時F1抗原產(chǎn)生的多，在28℃培養(yǎng)時產(chǎn)生極少。F1抗原的抗原性較強，特異性較高，有白細胞吞噬作用，可用凝集、補體結(jié)合或間接血凝檢測。,,2.鼠毒素和內(nèi)毒素 3.毒力V/W抗原：在

13、細胞表面，V抗原是蛋白質(zhì)，可使機體產(chǎn)生保護性抗體，W抗原為脂蛋白，不能使機體產(chǎn)生保護力。V/W抗原結(jié)合物有促使產(chǎn)生莢膜，抑制吞噬作用，并有在細胞內(nèi)保護細菌生長繁殖的能力，故與細菌的侵襲力有關(guān)。產(chǎn)生VW抗原的最適溫度是37℃，28℃培養(yǎng)時不產(chǎn)生此抗原。 4.抗原4和PH6抗原： 5.鼠疫桿菌素1(Pst1)。,鼠疫菌的質(zhì)粒,質(zhì)粒的定義：質(zhì)粒(Plasmid)是存在于細菌染色體以外的遺傳因子， 是環(huán)狀DNA， 能自主地進行復制， 控制

14、著寄主細胞的一定遺傳性狀。 如：E.coli的F.R、COL因子等。 質(zhì)粒的表示單位：mdal(百萬道爾頓)、Kb(一千堿基對) 1.4mdal=2.3Kb鼠疫菌質(zhì)粒的種類: 現(xiàn)已查明了鼠疫菌的某些毒力決定子是由質(zhì)?？刂频摹Ｊ笠呔?guī)范化的質(zhì)粒主要有：6mdal、45mdal、65mdal；其中6mdal質(zhì)粒編碼Pst1的產(chǎn)生；45mdal質(zhì)粒編碼VW；而65mdal質(zhì)粒決定F1抗原的產(chǎn)生。某一種質(zhì)粒的缺失可影響這一質(zhì)?？刂?/p>

15、的表型的表達。目前，質(zhì)粒已應用于鼠疫菌的診斷和疫源地的分類等分子流行病學工作。如利用6mdal(9.5Kb)質(zhì)粒的pla基因上的456kb及65mdal(100Kb)質(zhì)粒caf1基因上的207Kb特異性片段用PCR技術(shù)來診斷鼠疫菌。,鼠疫菌的病原性,鼠疫菌的病原性，也就是鼠疫菌作為病原微生物的一個種它能引起鼠疫疾病的能力。人類不分膚色、種族、年齡、性別，普遍易感?？偟膩碚f，鼠疫菌的病原性很強，其特點是有高度的攻擊性。在敏感動物內(nèi)，鼠疫

16、菌很快地沿著淋巴管及血管擴散，在臟器內(nèi)蓬勃的繁殖，并以敗血癥使動物死亡。,鼠疫噬菌體,鼠疫噬菌體的應用： 1.鼠疫菌的鑒定：由于鼠疫噬菌體在18～22℃時的噬菌作用具有種的特異性，即只能裂解鼠疫菌，故可用作鼠疫菌的鑒定方法之一。 2.鼠疫菌的快速診斷 3.判定檢材的間接指征,二、疑似鼠疫患者的取材（一）,1.1 疑似鼠疫病人應在服用抗菌藥物前，依其癥狀和體征，按以下規(guī)定部位采取檢材。1.2 各型疑似鼠疫患者

17、，除采取相應部位材料外，均應采取靜脈血3～5mL，供檢菌和血清學診斷用。,1.3疑似腺鼠疫病人取材,1 選取腫大淋之淋巴結(jié)，用碘酒、酒精局部消毒，以左手姆指、食指固定，用滅菌注射器(12～16號針頭)刺入淋巴結(jié)，抽取組織液適量，保存于滅菌試管內(nèi)或直接接種于血瓊脂平板。2 淋巴結(jié)腫大不明顯者，可先向淋巴結(jié)內(nèi)注射0.3～0.5mL滅菌生理鹽水，稍停后再行抽取。3 感染后期，可在腫大的淋巴結(jié)周圍穿刺抽取組織液。,1.4疑似肺鼠疫病人取材,

18、1 令病人對血瓊脂平板咳嗽，或?qū)а狄簶吮臼占跍缇矫蠡驈V口瓶內(nèi)備檢。2 用滅菌棉拭子涂擦咽部分泌物，將拭子保存于滅菌試管或滅菌生理鹽水管內(nèi)備檢。,1. 疑似鼠疫病人的取材（二）,1.5 疑似敗血型鼠疫應采取靜脈血液1mL以上 1.6 疑似眼鼠疫應用棉拭子或無菌毛細吸管，采取眼的分泌物。1.7 疑似腸鼠疫應取病人糞便備檢。1.8 疑似皮膚型鼠疫取材。,,1.8疑似皮膚型鼠疫取材,1 水泡、膿泡期，可將膿泡表面用酒精消毒

19、，以滅菌注射器由泡的側(cè)面刺入泡內(nèi)，抽取內(nèi)容物備檢。2 潰瘍、結(jié)痂其以滅菌鑷子持滅菌棉球涂擦潰瘍面和痂皮下的創(chuàng)面，將棉球保存于滅菌試管或滅菌鹽水內(nèi)備檢。,1. 疑似鼠疫病人的取材（三）,1.9疑似腦膜炎型鼠疫的病人用腰椎穿刺法抽到腦脊液備檢。1.10對于鼠疫病人的密切接觸者，鼠疫污染材料的接觸者，以及早期未出現(xiàn)典型可疑癥狀的疑似鼠疫病人，均應按1.2和1.4的規(guī)定取材備檢。,2.疑似鼠疫尸體的取材,2.1首例疑似鼠疫尸體應作

20、解剖取材。2.1.1取材前應作好解剖器材、場所選擇和尸體處理的準備。2.1.2 以無菌手續(xù)采取肝、脾、肺、心血及有可疑病理改變的淋巴結(jié)等，分別置于滅菌平皿或試管內(nèi)保存。尸體有腐敗跡象時，必須取長骨材料。2.2 如不能解剖，可行局部取材。用腰椎穿刺器按淋巴結(jié)、心、肝、脾及肺的順序穿刺采取組織，分別保存于滅菌試管內(nèi)，尸體腐敗時可穿刺取骨髓。,三、 動物和昆蟲材料的采集,3.1病死動物的取材 3.2 一般動物的取材 3.3 昆蟲

21、材料的采集,3.1 病死動物的取材,病死動物、病鼠或疑為敵人撤放的活鼠，解剖取材時，先用常水或3％來蘇兒液將鼠體沾濕，以不流水為宜。不得將來蘇兒帶入臟器，然后按先皮下后胸腔，最后腹腔的順序解剖。采取腹股溝，腋窩等腫脹的淋巴結(jié)，肝臟、脾臟，肺臟和心血備檢。取材時宜采取有明顯病變的部位。每取完1個臟器后，剪刀、鑷子都要沿酒精火餡滅菌1次。 若臟器腐敗或殘缺不全，則應取骨髓檢查，通常取股骨的骨髓。,3.2 一般動物的取材,一般捕獲的活鼠及捕

22、獲時打死的鼠類，包括捕獲的其他種動物或經(jīng)毒鼠藥毒死的鼠類及其他動物。解剖時消毒方法與病死動物相同，取材料時一般情況下只取肝、脾即可，取法同上。,3.3 昆蟲材料的采集,蚤的染菌率高，鼠疫菌能長期在蚤體內(nèi)保存，且蚤不易腐敗，易運輸，并可大面積搜集。在某些情況下，檢查跳蚤比檢查嚙齒動物能更快的發(fā)現(xiàn)疫源。 從病死鼠或捕獲鼠身收集的跳蚤以及在發(fā)現(xiàn)鼠尸附近的洞中采集跳蚤,均需仔細加以檢查。 供細菌檢查的蚤最好是活蚤，揀蚤時可將同一鼠體蚤梳入盛

23、有1／20萬龍膽紫2％鹽水的蚤管內(nèi)，統(tǒng)一鑒定后作好記錄，檢查方法可分組或單匹取材 。,3.3.1．集組檢驗,當檢獲大量蚤時，可按地區(qū)、宿主、蚤種進行分組檢驗，每組以15～20匹為宜，最多不超過50匹。分組后用滅菌生理鹽水洗滌3次，置于滅菌乳缽內(nèi)研碎，加少許生理鹽水研磨成懸液備檢。 3.3.2．單匹檢驗單匹拉胃培養(yǎng)法 單匹壓碎培養(yǎng)法,材料的保存和送檢方法,3.凡所取材料均應保存于滅菌器皿內(nèi)；組織塊可保存于滅菌生理鹽水中，或用5～10

24、mL Broke氏液保存；亦可應用Cary Bleir培養(yǎng)基保存運送材料。4.所取標本按照衛(wèi)生部《人間傳染的病原微生物名錄》的規(guī)定進行包裝。5.準確詳細填寫送檢單。6.運輸按照衛(wèi)生部《可感染人類的高致病性病原微生物菌（毒）種或樣本運輸管理規(guī)定》執(zhí)行7.接交材料時首先檢查包裝，絕對不能有破損、污染，如有破損應立即消毒并報告有關(guān)單位處理。材料接交清單點清種類、數(shù)量，并準確記錄簽字。,鼠疫細菌檢驗程序及結(jié)果判定,1鼠疫細菌檢驗基本

25、要求1.1鼠疫細菌檢驗必須在衛(wèi)生部《人間傳染的病原微生物名錄》規(guī)定的相應等級的生物安全實驗室內(nèi)進行。1.2 檢驗人員必須事前熟悉實驗室管理制度，自身防護制度，技術(shù)操作規(guī)程等。1.3凡進入毒菌室操作，必須兩人以上同時工作。1.4及時準確做好檢驗的各項實驗記錄。,,,根據(jù)ws279-2008附錄B規(guī)定,,,,,,,,,,,,,,涂片染色結(jié)果觀察,典型的鼠疫桿菌短而粗、兩極濃染、兩端鈍園、中間澎大，幾乎成卵園或橢園形，菌體長約1.

26、5～1.8微米，寬0.5～0.7微米。有莢膜、無鞭毛、無芽胞。革蘭氏染色陰性。死于鼠疫的人尸和動物尸體的新鮮臟器制備的涂片，可見到兩端鈍園，兩極濃染的典型鼠疫桿菌，呈散在或小堆，偶見鏈狀排列。在壓印標本中，可以看到吞噬細胞內(nèi)外有鼠疫桿菌。此點對于鑒別雜菌污染材料有很大的價值，因為動物死后，污染的雜菌不會被吞噬細胞所吞噬。,3. 細菌培養(yǎng),3.1新鮮材料可直接涂布溶血(0.1%)赫氏瓊脂平板，按三段法劃法。3.2腐敗材料可劃線于龍

27、膽紫(1∶10萬～1∶20萬)亞硫酸鈉(0.025%)平板或龍膽紫溶血平板。3.3液體材料及骨髓，用滅菌白金耳取標本劃線。臟器材料先在平板表面壓印，再以白金耳劃線，棉拭子可直接涂布于培養(yǎng)基表面。3.4同一病人或尸體的不同材料可以分格涂于同一平板表面。每份材料接種一式兩個平板，一個作分離培養(yǎng)，另一個準備做鼠疫噬菌體裂解試驗。3.5置28℃溫箱培養(yǎng)，于14～96h內(nèi)每日觀察發(fā)現(xiàn)具有鼠疫菌型形態(tài)的菌落。沒有嚴重污染的平板，必須持續(xù)培養(yǎng)

28、7d，無疑似鼠疫菌落出現(xiàn)時，始可棄去。,細菌培養(yǎng)結(jié)果觀察,鼠疫桿菌在普通瓊脂平碟上，經(jīng)過24小時即能形成肉眼可見的薄薄一層淡灰色的微小菌落.直徑0.1--0.2毫米，有光澤、園形、中心稍凸出、無色。顯微鏡下觀察可見碎玻璃片樣透明幼小菌落。培養(yǎng)48小時后，用顯微鏡觀察時，能很清楚的看見非常透明而不整齊的花邊分布在集落中心凸出部的周圍。菌落中心部呈顆粒狀，或者甚至呈小丘起伏狀，并呈淡黃色或稍呈黃褐色?；ㄟ厧О咨?，并且?guī)缀跏峭该鞯摹?4.

29、鼠疫噬菌體裂解試驗,4.1 在3.4中用于噬菌體裂解試驗的平板上，于劃線一側(cè)滴噬菌體一滴，傾斜平板使其垂直流過劃線。4.2 分離培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)可疑鼠疫菌落時，用白金耳取可疑菌落重新劃線于血瓊脂平板，再依上法滴加鼠疫噬菌體。4.3 置28℃溫箱，24h觀察有無噬菌現(xiàn)象，噬菌帶于噬菌體流過的痕跡時，方可判定為鼠疫噬菌體試驗陽性。,5. 動物接種（一）,5.1 病人、尸體材料，特別是腐敗材料必須在進行細菌培養(yǎng)的同時接種小白鼠(18～20

30、g)或豚鼠(250～300g)。5.2 臟器塊，置于消毒乳缽內(nèi)，用滅菌剪刀剪碎并研成勻漿，加入適量生理鹽水，制成懸液備用。5.3 新鮮材料可用腹腔或皮下接種，豚鼠接種0.5～1.0mL，小白鼠接種0.2～0.4mL。 5.4 腐敗材料可采用經(jīng)皮接種，剃去動物腹毛，并造成輕微劃痕，將材料以棉拭子涂布于剃毛之皮膚上并擦之，涂擦時應以平皿蓋，以防材料四濺。5.5 接種實驗動物后，做好標記，放入飼養(yǎng)籠內(nèi)，掛牌記載編號、接種日期、途徑等

31、。每日飼養(yǎng)1～2次，直至動物死亡或7d后然殺死剖檢。5.6 動物死亡后，按3和4進行檢驗。 ,5. 動物接種（二）,5.7 如7d動物沒有死亡，應處死動物，取動物的脾臟及有可疑病變組織制成勻漿，接種第2組動物，動物死亡或7d后處死，按5.6檢驗，同時采集血清，做被動血凝試驗。無陽性發(fā)現(xiàn)方可做出陰性報告。,6. 鼠疫菌判定依據(jù),6.1 分離獲得鼠疫菌落，并按4.3的標準判定鼠疫噬菌體裂解試驗陽性時，始可做出鼠疫細菌學判定。負責檢驗

32、的單位應在噬菌體裂解試驗結(jié)果產(chǎn)生后24h內(nèi)將鼠疫菌鑒定報告報送負責部門。并對過去所做的疑似鼠疫報告做出認定或訂正報告。6.2 實驗動物死亡，由死亡的實驗動物體內(nèi)重新分離到鼠疫菌，并經(jīng)噬菌體裂解試驗證實，負責檢驗的單位應做出鼠疫強毒菌的鑒定報告,判定鼠疫菌的標準依據(jù),———————————————————————————————————————————————————— 菌體形 　培養(yǎng)特性　 鼠疫噬菌體　 動物試驗 　

33、分析判定　態(tài)特點　　　 　　　裂解試驗（18～20℃） ———————————————————————————————————————————————————— ＋ －　　　　－ － 否　　　定 ＋ ＋ － 　　 ?。?重試仍為此結(jié)果

34、的可否定 ＋ ＋ 　 ＋ 　　 　 －　　　 判　　　定 ＋ ＋ ＋ 　　　 ＋ 　 　 判　　　定 － ＋ 　 ?。?＋ 判　　　定

35、 － ＋ ＋ 　　 　 － 　 　判　　　定 　 －　　 －　　　 　＋　　　　 ?。?疑似，在培養(yǎng)基中　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　加抗鼠疫噬菌體血清 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　再進行試驗————————————————————————————————————————————————

36、————,鼠疫血清學檢驗,一. 間接血凝試驗(PHA) 二. 反向血凝試驗（RPHA）一. 間接血凝試驗(PHA （一）適用范圍 （二）被檢材料（三）試劑（四）操作步驟（五）結(jié)果判定,（一）適用范圍,疑似鼠疫病人在急性期間及恢復期間，以及具有可疑鼠疫病史的人應取其靜脈血進行間接血球凝集試驗，以檢查血液中是否具有抗鼠疫菌F1抗體。（二）被檢材料各型鼠疫患者均應采取靜脈血3～5mL，分離血清。被檢血清均應56℃30m

37、m滅活供診斷用。,（三）試劑,2.5%F1抗原致敏血球。 1%正常兔血清鹽水。2.5%單寧酸血球。F1抗原液(50～100μg/mL)。,（四）操作步驟（一）,1. 取小試管(15mm×100mm)兩列，第一列第一管加入1%正常兔血清鹽水0.9mL，其余各管各加0.5mL，為血凝抑制列，第二列的各管加入0.25mL，為血球凝集列。2. 取被檢血清0.1mL加入第一列的第一管，進行雙排并列倍比稀釋如表C1所示，第一

38、管混勻后，吸取0.75mL，其中0.25mL加入第二列第一管內(nèi)，0.5mL加入第一列的第二管中，混勻后，再吸取0.75mL，依次如前稀釋，直至最后一管，棄0.5mL。,（四）操作步驟（二）,3. 第一列每管內(nèi)各加入0.25mLF1抗原液(50～100μg/mL)，混勻后置37℃溫箱10～15min。4. 于各管內(nèi)加入2.5%F1抗原致敏而球一滴(0.05mL)，混勻后置37℃溫箱，2h后觀察結(jié)果。 5. 試驗同時設(shè)下列對照管：

39、a) 1%正常兔血清鹽水0.5mL+2.5%F1抗原致敏血球0.05mL；b) 1%正常兔血清鹽水0.5mL+2.5%單寧酸血球0.05mL；c) 1∶20被檢血清0.5mL+2.5%單寧酸血球0.05mL；,（五）結(jié)果判定,1. 各對照管不應呈現(xiàn)疑集。2. 第二列為試驗更，根據(jù)血球凝集程度分為下列幾種：a) “#”凝集血球鋪滿管底，有明顯折邊，抗體過量時，凝集呈疏松花圈狀；b) “+++”凝集血球鋪滿管底，無折

40、邊；c) “++”血球不完全凝集，管底呈整齊的圓圈，但圈內(nèi)外有非常明顯的血球凝集；d) “+”管底形成較小的圓圈，在圈內(nèi)外只有很少的血球凝集。,著裝程序,1.穿內(nèi)隔離衣褲，2.戴白帽和小口罩，3.扎三角頭巾，4.穿防蚤襪及長筒膠靴，5.穿后開口的白大衣(偏衫)，6.戴20～24層的紗布大口或濾材口罩，7.戴醫(yī)用手術(shù)手套，必要時外面套細線手套，8.進行已知毒菌動物接種、解剖或菌種開封等工作應戴有機玻璃面罩或眼鏡，以防

41、操作時細菌濺入眼內(nèi)或臉部裸露皮膚。,卸裝程序,工作完畢外出前將雙手(戴著手套的)浸于3 ％的來蘇兒液內(nèi) 1～3 分鐘。外出后立即鎖門并到第二更衣室按下列順序卸裝及消毒： ①.脫線手套、脫口罩、(脫眼鏡)脫工作服、脫三角頭巾、脫膠手套、分別浸泡于消毒液內(nèi)。②.在2 ％來蘇兒內(nèi)洗手。③.脫膠靴、防蚤襪及隔離衣褲。④.用肥皂、清水洗手。⑤.用酒精棉球擦手。⑥.用3％硼酸水漱口。,鼠疫實驗室生物安全與技術(shù)規(guī)范,一.結(jié)構(gòu)上分四個等級