1、新型佐劑研究及其應(yīng)用概況,一、概論,凡是可以增強抗原特異性免答的物質(zhì)均稱為佐劑。,1、佐劑的定義,(adjuvant）一詞來源于拉丁語，原為輔助之意。在免疫學(xué)和生物制品學(xué)上又稱為免疫佐劑（immunologic adjuvant）。傳統(tǒng)的概念為：當(dāng)一種物質(zhì)先于抗原或與抗原混合或同時注射于動物體內(nèi)，能非特異性地改變或增強機體對該抗原的特異性免疫應(yīng)答，發(fā)揮其輔佐作用者，都稱之為佐劑。,2、作用特點,①能明顯增強多糖或多肽等抗原性微弱的物質(zhì)誘

2、導(dǎo)機體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答； ②用最少量的抗原和最少的接種次數(shù)刺激機體可產(chǎn)生足夠的免疫應(yīng)答和高滴度的抗體，在血流或粘膜表面能維持較長的時間，發(fā)揮持久的效果。,3、佐劑的作用,①改變正常免疫機能，吸引大量巨噬細胞以吞噬抗原；②改變抗原的構(gòu)型，使抗原物質(zhì)降解并加強其免疫原性；③延長抗原在組織內(nèi)的貯存時間，使抗原緩慢降解和緩釋，并發(fā)揮免疫系統(tǒng)的細胞間協(xié)同作用（巨噬細胞與T細胞，T細胞與B細胞）。,4、作用機理,①抗原遞呈（anti

3、gen presentation） 指抗原分子遞呈給T細胞的方法?？乖f呈的方法對免疫應(yīng)答的實質(zhì)和強度有重要影響。佐劑與疫苗的聯(lián)合使用，有助于抗原性物質(zhì)在胞內(nèi)被加工，被MHC分子特異性的結(jié)合、保護、運輸并遞呈給效應(yīng)細胞。,②抗原尋的（antigen targeting）,指抗原傳遞給免疫系統(tǒng)中適當(dāng)效應(yīng)細胞的效率。佐劑對于抗原尋的涉及到的一系列機制，包括吸引巨噬細胞到達組織部位、活化吞噬細胞、促進抗原與細胞受體的結(jié)

4、合等有重要作用。,③免疫調(diào)節(jié)（immune modulation）,是指任何可以修飾的免疫效應(yīng)細胞對抗原或表位進行加工的機制。通過這種機制，可以改變特異性免疫應(yīng)答的本質(zhì)或強度。T細胞有Th1和Th2兩個亞類。同一抗原和不同佐劑一起使用能夠引起不同的免疫反應(yīng)。因此，通過篩選特定的佐劑，可以達到誘導(dǎo)正確的免疫應(yīng)答的目的。,二、佐劑分類,按佐劑物理性質(zhì)，分為顆粒型佐劑和非顆粒型佐劑；按佐劑的生物學(xué)性質(zhì)（即Ballanti分類法），可分為微

5、生物及其組分與非微生物物質(zhì)；按佐劑在體內(nèi)存留的時間，則可分為貯存型佐劑（depot type adjuvant）和非貯存型（non-depot type adjuvant）。顆粒型佐劑多半屬于貯存型的，非顆粒型佐劑大多屬于非貯存型佐劑。,（一）顆粒性佐劑,1．鹽類佐劑：包括氫氧化鋁膠、各種明礬、磷酸鋁等。2．油水乳劑佐劑 ：如弗氏完全佐劑（Freund’s complete adjuvant, FCA）、弗氏不完全佐劑（Freun

6、d’s incomplete adjuvant, FIA）和礦物油白油佐劑。3．免疫刺激復(fù)合物（ISCOM）佐劑。,顆粒性佐劑,4．蜂膠佐劑（propolis）。5．脂質(zhì)體佐劑（liposomes）。6．其他：MF59佐劑、微囊化佐劑（microencapsulation）、硬脂酰酪氨酸佐劑（slearyltyrosine）和γ－菊粉（gamma-inulin）等。,（二）非顆粒性佐劑,1．肽類佐劑（peptides）：如胞壁酰二

7、肽（MDP）及其衍生物、去胞壁酰多肽（desmuramyl peptides）、脂肽（lipopeptides）和免疫調(diào)節(jié)多肽（immunomodulatory peptides）等。2．表面活性分子類佐劑（surface-active molecules）：如非離子阻斷共聚物表面活性劑（nonionic block copolymers）和海藻糖合成衍生物（TDM）等。,非顆粒性佐劑,3．核酸及其衍生物類佐劑（nucleic aci

8、d derivatives）：如合成核苷酸聚合體（synthetic olynucleotides）、次黃嘌呤衍生物（hypoxanthine derivatives）和免疫刺激序列DNA（CpG DNA或CpG 寡聚脫氧核苷酸（CpG-ODN））等。,非顆粒性佐劑,4．含硫復(fù)合物類佐劑（suiphur-containing compounds）：如左旋咪唑（levamisole）。5．碳水化合物高分子類佐劑（carbohydrate

9、 polymers）：如香菇多糖（lentinan）、硫酸多糖（sulfated polysaccharides）等其他一些多糖和DEAE-葡聚糖等。6．細胞因子類佐劑（cytokine）：如白介素-1（IL-1）、白介素-2（IL-2）、白介素-4（IL-4）和γ-干擾素（γ-IFN）等。,非顆粒性佐劑,7．脂質(zhì)分子類佐劑（lipid molecules）：如脂多糖及其衍生物（lipopolysaccharide derivativ

10、es），一些脂溶性維生素（fat-soluble vitamins）如維生素A和維生素E等。8．其他：包括一些蛋白毒素如霍亂毒素（CT）、百日咳毒素（PT）和破傷風(fēng)類毒素（TT）等；脂磷壁酸（LTA）；維生素B12等。,常規(guī)佐劑和新型免疫佐劑,目前，鋁鹽類佐劑、油水乳劑佐劑和蜂膠佐劑等比較常用，屬于常規(guī)佐劑。細胞因子類佐劑、 CpG DNA、基因工程減毒素、免疫刺激復(fù)合物佐劑、脂質(zhì)體佐劑及MF59佐劑等是目前研究的熱點，其中有些也已

11、經(jīng)開始用于生產(chǎn)實際，屬于新型免疫佐劑。,三、常規(guī)免疫佐劑,（一）鋁鹽類佐劑該類佐劑在生物制品上應(yīng)用廣泛，對體液免疫作用很明顯，與抗原混合注射時，可通過抗原尋的過程顯著增高抗體滴度?？扇苄钥乖c此類佐劑混合后成為凝膠狀態(tài)，可建立一個短時的貯存顆粒，將可溶性抗原轉(zhuǎn)化為一種便于吞噬的形式，以利于巨噬細胞吸附。,1．氫氧化鋁膠,又稱鋁膠，其佐劑活性與質(zhì)量密切相關(guān)，質(zhì)優(yōu)的鋁膠分子細膩、膠體性良好、穩(wěn)定，吸附力強，保存兩年后其吸附力不變。鋁膠可用

12、于制造多種獸用疫苗。各廠家采用不同的合成方法制備鋁膠，優(yōu)點各異。,制法,（1）用鋁粉加燒堿合成法：用量按下列反應(yīng)式計算： 2Al(OH)3+12H2O+3H2SO4→Al2(SO4)3·18H2OA12(SO4)3·18H2O+6NaOH→2Al(OH)3+2Na2SO4+18H2O（2）用明礬加碳酸鈉合成法：用量按下列反應(yīng)式計算：2 KAl(SO4)2+3Na2CO3+3H2O→2Al(OH)3+3N

13、a2SO4+3CO2↑。（3）用三氯化鋁與氫氧化鈉合成：A1C13+3NaOH→Al(OH)3↓+3NaCl。此法合成的鋁膠含量低，透明無沉淀，目前廣泛用于制備人用生物制品，認為佐劑效果良好，注射部位無硬結(jié)反應(yīng)。,配制時注意事項：,①氫氧化鋁具有較強的吸附力，所以，制膠過程中一般用軟化水或去離子水洗滌。②氫氧化鋁膠為兩性化合物，過酸或過堿都會失去膠態(tài)。故要掌握好化合時的pH值。③貯存鋁膠應(yīng)放在耐酸搪瓷缸或耐酸池中，并嚴密封蓋，貯放

14、期不超過3個月。④鋁膠室溫保存，以免破壞膠態(tài)。,2．明礬（Alum）,有鉀明礬（KAl（SO4）2·12H2O）和銨明礬（AlNH2（SO4）2·12H2O）兩種。作為佐劑用于生物制品的主要是鉀明礬（即硫酸鋁鉀）。制造時，先將滅活菌液調(diào)至pH 8.0土0.1，選精制明礬制成10％溶液，高壓滅菌后，冷至25℃以下備用。按菌液量加入明礬溶液1～2％，充分振蕩，然后沉淀。佐劑作用與氫氧化鋁膠近似，但該法較簡便，應(yīng)用

15、較廣，如破傷風(fēng)明礬沉淀類毒素和氣腫疽明礬滅活疫苗等。在美國只有明礬可在人體中應(yīng)用。,3．磷酸三鈣,在疫苗中加入氯化鈣和磷酸氫二鈉，使在疫苗中化合成磷酸三鈣，吸附抗原后沉淀，所制出的幾種疫苗免疫效果良好。此法簡便，質(zhì)量穩(wěn)定。鋁鹽類佐劑成本低廉，使用方便，安全性較好，已被廣泛用于獸用疫苗，乙肝、白喉等重組疫苗的佐劑。,缺點：,①輕度局部反應(yīng)，可形成肉芽腫，個別形成局部無菌性膿腫；②鋁膠疫苗怕凍，凍后鋁膠易變性；③有可能對人、畜神經(jīng)系

16、統(tǒng)有影響；④主要激活Th2免疫細胞，誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答。而誘導(dǎo)細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答作用不明顯。只適用于以抗體為主要保護性免疫的疾病的疫苗，如白喉、破傷風(fēng)、乙肝、麻疹等。,（二）油乳佐劑,指一類由油類物質(zhì)和乳化劑按一定比例混合形成的佐劑，如弗氏佐劑。該類佐劑主要在抗原尋的過程中起作用，使抗原在注射部位保持穩(wěn)定，為抗原在淋巴系統(tǒng)中轉(zhuǎn)運提供載體，增加單核細胞的形成和積聚。油乳劑疫苗的免疫效力高低，直接與乳化作用的好壞和乳劑成分的質(zhì)量等有關(guān)。

17、一種好的乳劑疫苗應(yīng)是油包水（水/油或W/O）或水包油（油/水或O/W）型，粘度低，顆粒均勻，穩(wěn)定性良好，呈乳白色。,1．乳劑的概念,“乳劑”是將一種溶液或干粉分散成細小的微粒，混懸于另一不相溶的液體中所成的分散體系。被分散的物質(zhì)稱為分散相（內(nèi)相），承受分散相的液體稱連續(xù)相（外相），兩相間的界面活性物質(zhì)稱為乳化劑。當(dāng)以水為分散相，以加有乳化劑的油為連續(xù)相時，制成的乳劑為W/O型，反之為O/W型。,W/O型、O/W型乳劑比較,制成什么樣的

18、乳劑型，與乳化劑及乳化方法密切相關(guān)。通常W/O型乳劑較粘稠，在機體內(nèi)不易分散，佐劑活性較好，為生物制品所采用的主要劑型；O/W型乳劑較稀薄，注入機體后易于分散，但其佐劑活性很低，生物制品一般不采用這種劑型。,2．乳化劑,（1）乳化劑的種類天然乳化劑：來自動植物，如阿拉伯膠、海藻酸鈉、蛋黃以及煉乳等。人工合成乳化劑，再分為離子型和非離子型。,離子型乳化劑,陰離子型：如堿肥皂、月桂酸鈉、十二烷基磺酸鈉和硬脂酸鋁等，多用于乳化一般生物

19、制劑；陽離子型：陽離子類乳化劑有氯化苯甲烴銨、溴化十六烷三甲基和氯化十六烷銨代吡啶等，用于制備一般的水包油生物制劑。,非離子型乳化劑,多數(shù)是多元醇或聚合多元醇的脂肪酸脂類或醚類物質(zhì)，如月桂酸聚甘油脂、山梨醇脂和單油酸脂等。它們具有一定的親水性和親油性基團，為制造醫(yī)藥或化妝品的乳化劑。制備注射用油乳劑滅活疫苗，最適用的乳化劑有去水山梨醇單油酸酯（其中，司本-80和Arlacel-A是同類產(chǎn)品）、聚氧乙烯去水山梨醇單油酸酯（商品名吐溫

20、-80）和硬脂酸鋁等。,（2）乳化劑的選擇,通常可根據(jù)用途，依據(jù)乳化劑的HLB值（親水親油平衡值）進行選擇。乳化劑的HLB值與其在水中的溶解度相關(guān)；親油性的在水中溶解度小，HLB值低，易形成油包水型油乳劑。HLB值為4～6的乳化劑適用于制造W/O型油乳劑；常用的司本-80，HLB值為4.3，在水中溶解度低，不易在水中分散，溶于多種有機溶劑，性質(zhì)穩(wěn)定，易形成W/O型油乳劑；親水性強的在水中溶解度大，HLB值高，容易形成水包油型油乳劑；

21、 HLB值在8～18的乳化劑適用于O/W型油乳劑。吐溫-80，其HLB值為15.0，易溶于水，易形成O/W型油乳劑。,3．白油佐劑,制苗用的白油應(yīng)無多環(huán)芳烴化合物、粘度低、無色、無味和無毒性。Drakocel-6VR、Marcol-52和Lipolul-4是國內(nèi)外常用的制苗用白油。我國目前選用杭州煉油廠的7號或10號白油和北京石油化工科學(xué)研究院的合成白油，其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為：無色無味，50℃運動粘度7m2／s左右，紫外吸收值（250～350

22、nm）＜0.1％，紫外消光系數(shù)＜12×108；單環(huán)芳烴與雙環(huán)芳烴含量低于0.5％，無多環(huán)芳烴；小鼠腹腔注射0.5ml或家免皮下注射2.0ml白油，觀察60d，表現(xiàn)正常。,4．乳劑配方與乳化方法,使用不同乳化劑和不同的配合比例及乳化方法，決定了制備乳劑的性狀和穩(wěn)定性。疫苗生產(chǎn)中主要有兩種基本方法。（1）劑在水中法：此法將乳化劑直接溶于水中，在激烈攪拌下將油加入，可直接生成O/W乳劑。若欲得W/O型，可繼續(xù)加入油，直到發(fā)生變型

23、。該法通常用勻漿器或膠體磨，高速攪拌而得到較好的乳劑。,（2）劑在油中法：,此法將乳化劑溶于油相，將油相直接加入水相中得O/W，如水相直接加入油相，得到W/O型，如欲得O/W，繼續(xù)加入至變型。該法制成的乳劑，一般均勻顆粒直徑在0.5µm左右，比較穩(wěn)定。,免疫實驗動物用的佐劑,其配方按容量計為：礦物油（白油）75%~85％， 乳化劑15％~25%，混合后經(jīng)除菌過濾而成為弗氏不完全佐劑（FIA）；如向其中

24、加入0.5mg／m1死結(jié)核桿菌即為弗氏完全佐劑（FCA）。 使用時，將含抗原的水相，與上述任一佐劑等量混合，用力振搖即可成為均勻的乳劑。 也可用9份油和1份司本-80混合后加2％吐溫-80和1％~2%硬脂酸鋁，經(jīng)高壓滅菌后備用，注射前將配好的油佐劑與抗原水相1：1混合，強力振搖，可配制成性狀良好的乳劑疫苗。,副作用,弗氏佐劑具有高度佐劑活性，因而應(yīng)用廣泛。但因副作用強烈而限制其應(yīng)用。很少用于動物免疫。

25、①油通過肌膜層造成組織損傷，局部形成結(jié)節(jié)和無菌性膿腫。②加入了結(jié)核菌素，能使PPD試驗陽性。③可能致癌；④過于粘稠，難以注射。,大量生產(chǎn),可將94％白油與6％司本-80混合后加1%~2％硬脂酸鋁，滅菌后即為油相；將抗原液加2％~4%吐溫-80為水相。乳化時，將油相與水相按3：1~2：1比例配制，先緩速混合，再通過膠體磨充分乳化，可獲得穩(wěn)定的油包水乳劑苗。雙相乳劑疫苗：將粘稠的W/O乳劑疫苗，再加2％吐溫-80生理鹽水，通過攪拌

26、或膠體磨乳化，可制成雙相乳劑疫苗（水-油-水乳劑或稱多型乳劑Multiple emulsion adjuvant）。優(yōu)點是：粘稠度低、在注射部位易分散、局部反應(yīng)輕微及佐劑效應(yīng)良好等。,5．油乳劑檢驗,生產(chǎn)實際中以粘度測定和穩(wěn)定性測定為主。 （1）粘度測定：最簡易的方法是取內(nèi)口直徑為1.2mm的吸管，在室溫下吸滿lml乳劑，垂直放出0.4ml所需時間作為粘度單位，以0.4ml 2～6S為合格，不得多于10～15S，否則注射時就比

27、較困難。也可用Saybolt粘度計。（2）乳劑穩(wěn)定性測定：①加速老化法：疫苗于37℃貯存10～30d不破乳。②離心加速分層法：在一個半徑為10cm的離心器中裝油乳劑，3 000rpm離心15min不分層，相當(dāng)于保存1年以上不破乳。,（三）蜂膠佐劑,1．蜂膠的理化特性與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蜂膠（Propolis）是蜜蜂采自柳樹、楊樹、栗樹和其它植物幼芽分泌的樹脂，并混入蜜蜂上顎腺分泌物，以及蜂蠟、花粉及其它一些有機與無機物的一種天然物質(zhì)，含有多種

28、黃酮類、酸類、醇類、酚類、脂類、烯烴和萜類等化合物及多種氨基酸、酶、多糖、脂肪酸、維生素及化學(xué)元素，是一種優(yōu)良的天然藥物。,3．蜂膠的佐劑作用,蜂膠具有廣泛的生物活性和藥理作用。具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、消炎、增強機體免疫功能和促進組織再生等作用。蜂膠具有良好的免疫增強作用。它能保持抗原特性，增強巨噬細胞的吞噬能力，促進抗體的產(chǎn)生，提高機體的特異性和非特異性免疫力。,4．蜂膠佐劑疫苗制備方法,（1）蜂膠的處理：用市售蜂膠，放4℃以下

29、低溫貯存，用前在4～8℃下粉碎，過篩，按1：4（W/V）加95％的乙醇，室溫浸泡24～48h，冷卻，過濾或離心取上清，即得透明栗色純凈蜂膠浸液。除去干渣計算出浸液中含蜂膠量，浸液4℃以下保存?zhèn)溆谩?（2）蜂膠佐劑疫苗的制備,（以禽霍亂蜂膠疫苗為例）：將純凈培養(yǎng)的雞多殺性巴氏桿菌液，經(jīng)甲醛滅活后，加入蜂膠乙醇浸液，使每毫升菌液中含蜂膠10mg，邊加邊搖蕩，迅即成為乳濁狀，即為蜂膠佐劑疫苗。,四、細胞因子類佐劑,1979年第2屆國際淋巴因子

30、會議命名第1個細胞因子白細胞介素2（interleukin-2，IL-2）在機體免疫系統(tǒng)活動過程中，有許多種體液性免疫分子和細胞因子參與。前者如免疫球蛋白、補體和胸腺肽類。后者作為免疫活性細胞間相互作用的介質(zhì)和強有力的蛋白性調(diào)節(jié)因子，可以調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、炎性反應(yīng)、組織修復(fù)、組織移植反應(yīng)和造血。,（一）細胞因子的概念與分類,細胞因子（cytokine）是機體的各種細胞在其生命周期中所釋放的具有不同生物學(xué)效應(yīng)的物質(zhì)，是免疫細胞間相互作用

31、的調(diào)節(jié)信號。該類物質(zhì)相互誘生，相互影響，構(gòu)成一個巨大的細胞因子網(wǎng)絡(luò)（cytokine network）系統(tǒng)，各種細胞借助自己所釋放的細胞因子完成各自的功能，在免疫應(yīng)答中發(fā)揮作用。,分類,一類為經(jīng)典的細胞因子，包括淋巴毒素（LT）、腫瘤壞死因子（TNF）、和干擾素（INF）等； 另一類為對體液免疫和細胞免疫具有調(diào)節(jié)作用的因子，其代表為白細胞介素（IL）和集落刺激因子（CSF），可以促進和抑制免疫應(yīng)答。 絕大多數(shù)的細胞

32、因子的分子量小于25KD，分子量最低者如IL-8僅8KD。 多數(shù)細胞因子以單體形式存在，少數(shù)以雙體形式發(fā)揮生物學(xué)作用。,（二）細胞因子的作用特點,1．多效性：①免疫調(diào)節(jié)作用的多樣性：如IL-6除參與B細胞的分化、增值調(diào)節(jié)、抗體形成外，還對骨髓造血干細胞定向分化起重要作用，引起炎癥反應(yīng)及較強的抗病毒活性；②作用方式的非特異性：由特異性抗原或非特異性因子誘生的細胞因子，均以非特異性方式起作用，既不與抗原發(fā)生反應(yīng)，也不表現(xiàn)抗原特

33、異性。,細胞因子的作用特點,2．靶細胞的多樣性：細胞因子作用的靶細胞多種多樣，包括單核-巨噬細胞、淋巴細胞、多型核白細胞、胸腺細胞、NK細胞、骨髓細胞和成纖維細胞等。該特征是構(gòu)成機體復(fù)雜的細胞—細胞調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的基礎(chǔ)。3．多源性： 表現(xiàn)為一種細胞因子可由多種不同來源的細胞產(chǎn)生，如可產(chǎn)生IL-1的細胞有B細胞和NK細胞等免疫活性細胞及巨噬細胞、樹突狀細胞、郎罕氏細胞和星形細胞等抗原提呈細胞； 一種免疫細胞可以產(chǎn)生多種細胞因子。 T細胞可產(chǎn)

34、生IFN-γ、TNF及IL等細胞因子。,細胞因子的作用特點,4．高效性：細胞因子的作用方式與內(nèi)分泌激素類似，有內(nèi)分泌（endocrine）、旁分泌（paracrine）及自分泌（autocrine）等幾種形式，因此又有免疫激素（immune hormone）之稱。細胞因子在機體內(nèi)的產(chǎn)量雖很低，但都表現(xiàn)極高的生物學(xué)活性，10-1～10-15M即可顯示明顯的生物學(xué)活性。5．快速反應(yīng)性：即對激發(fā)因素的迅速反應(yīng)。細胞因子是一種分泌型蛋白質(zhì)，當(dāng)

35、免疫細胞受到刺激后，迅速在粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)合成，轉(zhuǎn)移到高爾基體內(nèi)糖基化，然后通過分泌顆粒不斷排出細胞外。它在細胞內(nèi)極少存儲，一旦刺激終結(jié)，即停止合成，并迅速降解。,（三）細胞因子的應(yīng)用,1．作為免疫佐劑，提高疫苗的免疫效果：有些疫苗特別是死苗和亞單位苗免疫效果往往不理想，而多種細胞因子可以調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，是有效的免疫增強劑，可提高機體免疫應(yīng)答能力，明顯提高疫苗的免疫效果。但細胞因子佐劑活性一般不如常規(guī)佐劑。,2．作為免疫治療劑，預(yù)防和治療某

36、些病原感染,用細胞因子處理未感染動物，可以增強動物的免疫功能，起到免疫治療的作用。如TNF、IL-1、IL-6和IL-8等細胞因子均參與機體的炎癥反應(yīng)過程；許多細胞因子對外來致病微生物及對腫瘤細胞生長都有抑制作用，在臨床上具有潛在的應(yīng)用價值。,3．通過基因重組，構(gòu)建新型基因工程疫苗：,將細胞因子基因插入一些基因缺失疫苗或活載體內(nèi)，并使之表達，可以克服一些疫苗在特定狀態(tài)下的安全問題，從而獲得理想的疫苗。如把小鼠或人IL-2的cDNA與含

37、禽流感血凝素（HA）基因的痘病毒重組，獲得可以表達IL-2的重組痘病毒。裸鼠免疫試驗結(jié)果顯示，IL-2的插入并不影響HA的表達水平及免疫原性，并且可以防止禽流感病毒對裸鼠的致死，說明插入細胞因子可以大大提高活病毒載體的安全性。,（四）幾種重要的細胞因子,1．白細胞介素-1（IL-1）：又稱淋巴細胞活化因子，是由抗原-抗體復(fù)合物、ConA、PPD、LPS及MDP等誘導(dǎo)巨噬細胞、單核細胞和其它多種組織細胞活化后分泌產(chǎn)生的一類激素樣多肽。分

38、子量15～20kDa，在pH值4～12之間穩(wěn)定，60℃1h作用不被破壞，可被蛋白分解酶處理而失活，可抵抗神經(jīng)氨糖酸苷酶處理。,IL-1是細胞因子網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵因子,可作用于多種免疫活性細胞，并擴大其功能，在抗感染免疫、抑制腫瘤細胞生長（抗腫瘤免疫）及維持機體內(nèi)環(huán)境的平衡（免疫自穩(wěn)）中起著重要作用。目前，多種動物的IL-1 cDNA已被克隆，如豬、牛和羊等，也已獲得重組IL-1；人的IL-1已工業(yè)化生產(chǎn)，正在進行臨床治療試驗，主要

39、用作免疫增強劑。在動物醫(yī)學(xué)上，IL-1主要用作免疫佐劑，可提高抗體滴度，但它也有明顯的副作用，主要表現(xiàn)為發(fā)熱和拉稀等。,2．白細胞介素-2（IL-2）：,是T細胞在抗原或促有絲分裂原（如ConA）刺激下所分泌的一種淋巴因子，可引起T細胞增殖和維持T細胞在體外的持續(xù)生長，故曾稱為T細胞生長因子（TCGF）。IL-2是一種糖蛋白，含133個氨基酸；分子量為15～35kDa，于70℃30min及pH值2～9范圍內(nèi)穩(wěn)定，無抗原特異性。具有

40、促進T細胞生長、誘導(dǎo)或增強細胞毒性細胞的殺傷活性、協(xié)同刺激B細胞增值及分泌免疫球蛋白、增強活化的T細胞產(chǎn)生IFN和CSF、誘導(dǎo)淋巴細胞表達IL-2R、促進少突膠質(zhì)細胞的成熟和增殖及增強吞噬細胞的吞噬殺傷能力等免疫生物學(xué)效應(yīng)。,,作用于多種免疫細胞，包括T、B淋巴細胞，巨噬細胞和NK細胞等，對免疫應(yīng)答有廣泛的上調(diào)作用。IL-2是人和獸藥研究中研究最多的細胞因子，除作用于外周T細胞增殖及抑制T細胞凋亡外，可能具有刺激胸腺產(chǎn)生T細胞的作用，

41、從而為免疫重建起作用。,3．白細胞介素-4（IL-4）：,又稱為B細胞刺激因子（BSF-1），是由Th細胞經(jīng)抗原或絲裂原刺激后產(chǎn)生的一類重要的淋巴因子。為蛋白性質(zhì)的肽類，分子量15～20kDa，有2～3個糖基化部位，由140個氨基酸構(gòu)成。IL-4對多種細胞均有作用，是細胞因子網(wǎng)絡(luò)中的重要組成部分。IL-4主要刺激B細胞的分化增殖，它能上調(diào)MHCⅠ類抗原、人白細胞功能相關(guān)抗原-Ⅰ的表達，在體外，可增加CTL細胞毒作用和刺激TIL的溶解

42、和擴增。對T、B淋巴細胞分化和成熟具有潛在的佐劑活性。它能激活T細胞、B細胞、NK細胞和自身受體IL-4R，增強或抑制免疫球蛋白的合成，可能成為一種強有力的佐劑候選因子。,4．白細胞介素-6（IL-6）：,是細胞因子網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵成分，除影響B(tài)細胞和T細胞的增生與分化外，還參與CTL分化及對顆粒細胞和巨噬細胞的作用。,5．白細胞介素-12（IL-12）：,是目前發(fā)現(xiàn)的唯一主要由B細胞產(chǎn)生的細胞因子，與IL-2有協(xié)同作用，所以曾被稱為細胞

43、毒淋巴細胞成熟因子（CLMF）和天然殺傷細胞刺激因子（NKSF）。IL-12為糖蛋白，分子量75kDa，由40kDa（P40）和35kDa（P35）兩個亞單位構(gòu)成，兩個亞單位完全由不同的基因所編碼，只有結(jié)合為一個完整的分子時才能發(fā)揮生物學(xué)活性。IL-12與亞劑量的IL-2能協(xié)同誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生細胞毒T淋巴細胞（CTL）。,白細胞介素-12（IL-12）：,IL-12還能誘導(dǎo)NK細胞和T細胞產(chǎn)生IFN-γ。IL-12活性高于IL-2和IFN

44、，在極低濃度時（1-30ppm）就有顯著活性，對滅活疫苗、腫瘤和寄生蟲抗原具有有效的佐劑活性。IL-12誘導(dǎo)產(chǎn)生的Th1應(yīng)答反應(yīng)尤為引人注目，是最強的NK細胞激活因子，也是迄今為止誘導(dǎo)Th1型免疫應(yīng)答最主要的細胞因子。在Th1免疫反應(yīng)的起始和抗原特異性CTL激活過程中起關(guān)鍵作用。可望用于主要誘導(dǎo)細胞免疫應(yīng)答的疫苗佐劑。,6．白細胞介素-18（IL-18）：,也稱為IFN-γ誘導(dǎo)因子，是新近發(fā)現(xiàn)的鼠和人的細胞因子，可強烈誘導(dǎo)Th1細胞因

45、子的產(chǎn)生，激活NK細胞，高效分泌IFN2γ，刺激T細胞增殖和增強CTL的活性，與IL-12產(chǎn)生協(xié)同作用等。,7．γ-干擾素（interferons-γ，IFN-γ）,是由致敏T細胞（Th1細胞和NK細胞等）在活的或滅活的病毒等干擾素誘生劑和某些細胞因子作用下所產(chǎn)生的一類高活性多功能的糖蛋白，分子量20～25kDa，由144個氨基酸組成，等電點8.6。它的分子量小，可以自由出入細胞，作用無特異性。 具有抗病毒、抗腫瘤、抑制細胞

46、分裂、免疫調(diào)節(jié)和免疫佐劑等多種免疫生物學(xué)活性。具有廣譜的抗病毒作用，使病毒增殖量減少，細胞損傷程度降低，其作用是抑制病毒的復(fù)制。還能增強T細胞、B細胞、NK細胞的活性.,作用,它促使宿主細胞阻止病毒生長，細胞產(chǎn)生一種抗病毒的物質(zhì) 再阻止宿主細胞為病毒譯制病毒蛋白質(zhì) 阻止病毒增殖。IFN-γ的佐劑作用主要是誘導(dǎo)MHC-Ⅱ的表達。當(dāng)IFN-γ與抗原在同一位置同時使用時，佐劑效果最好。,,,,應(yīng)用,目前，我國已開發(fā)研制成功豬白細

47、胞干擾素（swine interferon）。該制品系用雞新城疫病毒誘導(dǎo)健康豬白細胞，經(jīng)培養(yǎng)、滅活病毒、除菌、分裝等工藝制成。用于防治豬流行性腹瀉，每頭每日肌肉注射一次，乳豬10，000單位，仔豬20，000單位；病重者每天可注射兩次，連續(xù)3～5d為一個療程。,豬用干擾素：,主要用于TGE、PED、RV感染，口蹄疫，豬瘟、蘭耳病、園環(huán)病毒感染，PR、SI，水皰病，細小病毒等防治，特別是與豬用轉(zhuǎn)移因子協(xié)同應(yīng)用，效果更佳。每40公斤體重肌

48、肉注射1毫升，每日1次，連用3天。重癥加量2-3倍。與豬用轉(zhuǎn)移因子聯(lián)合應(yīng)用，用滅菌用水或生理鹽水稀釋，分別肌注。,使用注意點及使用法：,1、在使用后96小時內(nèi)不要接種弱毒苗，可以同時使用滅活苗，但不要混合注射。2、用滅菌用水或生理鹽水稀釋，不能用酸堿性溶液或葡萄糖鹽水稀釋。3、妊娠母豬、哺乳母豬及仔豬使用安全。4、啟用后在規(guī)定時間內(nèi)一次用完，解凍溶化后不要再進行冰凍，在4℃可存放3天。,應(yīng)用注意點,5．治療病毒性腹瀉，同時肌注復(fù)方

49、穿心連或雙黃連或痢菌凈或氟哌酸等止瀉消炎的藥，每日1-2次，連用4天。并改飲電解質(zhì)多維或口服補液鹽7天。6．口蹄疫：配合轉(zhuǎn)移因子注射。同時配合肌注復(fù)方靈芝多糖注射液或復(fù)方黃芪多糖注射液，并與防止心肌炎的藥物，如天王大敗毒注射液或五毒康注射液聯(lián)合應(yīng)用。每日1-2次，連用3天。,7．其它病毒感染：,同時配合肌注復(fù)方靈芝多糖注射液或復(fù)方黃芪多糖注射液或復(fù)方柴胡注射液等抗病毒的藥物，每公斤體重肌肉注射0.1毫升，每日1次，連用3-4天。要配

50、合使用廣譜抗生素,如頭孢噻呋,替米考星,氟苯尼考,強力霉素、阿莫西林、磺胺類藥物。注射或飼料加藥。為增強療效，配合轉(zhuǎn)移因子，每100公斤體重肌肉注射1毫升，每日1次，連用3天。,二、CpG DNA,CpG DNA是含有非甲基化CpG（胞嘧啶鳥嘌呤二核苷酸）基序的脫氧核糖核酸DNA。CpG基序（CpG motif）是具有較強免疫活性的以非甲基化的CpG為基元構(gòu)成的回文序列，其堿基排列大多為5′--Pur Pur- CG- Pyr Py

51、r--3′，也稱為免疫刺激序列（ISS，immunostimulatory DNA sequences）。,CpG DNA,在動物體內(nèi)能誘生強烈的免疫反應(yīng)，在誘導(dǎo)機體非特異性免疫應(yīng)答、增強抗原特異性免疫應(yīng)答及調(diào)控免疫應(yīng)答類型（Th1或Th2型）等方面發(fā)揮重要作用。激活NK細胞和巨噬細胞；刺激B淋巴細胞增殖、分化及產(chǎn)生免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）；誘導(dǎo)分泌IL-6、IL-12、TNF-α和IFN-γ等多種細胞因子；

52、誘導(dǎo)抗抗體誘生的細胞凋亡。,（一）CpG DNA的免疫學(xué)活性,1．對B淋巴細胞的作用 細菌DNA可直接激活B淋巴細胞產(chǎn)生免疫球蛋白，此過程為非T細胞依賴性和非抗原特異性。如大腸桿菌質(zhì)粒DNA和CpG-ODN可在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)B淋巴細胞分泌IL-6等細胞因子。2．對巨噬細胞的作用 CpG DNA通?？芍苯蛹せ罹奘杉毎?，并促進多種Th1類細胞因子的分泌，如IL-12、TNF-α、IFN-α和IFN-β等。如細菌DNA和CpG-ODN均

53、可誘導(dǎo)小鼠巨噬細胞產(chǎn)生TNF-α mRNA。,CpG DNA的免疫學(xué)活性,3．對NK細胞的作用 CpG DNA不能直接活化NK細胞，但可通過輔助細胞刺激細胞因子（如IL-12、TNF-α、IFN-α/β）的釋放間接地作用于NK細胞。4．對淋巴細胞的作用 CpG DNA不能直接活化T淋巴細胞，但能夠在單核細胞和NK細胞分泌的細胞因子（如IFN-γ）作用下間接激活T淋巴細胞。,（二）CpG DNA的佐劑效應(yīng)與應(yīng)用前景,由于Th1免

54、疫反應(yīng)在微生物感染中具有重要作用，因而研究新型可誘導(dǎo)Th1免疫、安全、無副作用的佐劑，無論對獸用疫苗還是醫(yī)用疫苗都至關(guān)重要。合成的CpG-ODN可誘導(dǎo)巨噬細胞分泌IL-12、NK細胞分泌IFN-γ。這些細胞因子能誘導(dǎo)Th1細胞分化，顯示了CpG-ODN作為佐劑的潛在價值。而且CpG-ODN與鋁鹽佐劑有協(xié)同刺激活性，既能誘導(dǎo)強的體液免疫，又能誘導(dǎo)細胞免疫和粘膜免疫反應(yīng)。實驗動物模型研究發(fā)現(xiàn)，CpG DNA對治療病毒感染、哮喘、過敏性疾

55、病及腫瘤均有良好的效果。,三、基因工程減毒素,基因工程減毒素是一類免疫佐劑的總稱。細菌細胞壁成分或毒素不但能刺激機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，而且在和抗原一起使用時，具有明顯的佐劑效應(yīng)。由于這些成分為細菌細胞壁成分或毒素，因而具有較強的毒性。該類毒素（尤其蛋白毒素）通過脫毒后，這些物質(zhì)可以起到良好免疫佐劑的功效。目前，已證明經(jīng)過基因突變體外表達的霍亂毒素（CT）、大腸桿菌不耐熱毒素（LT）和破傷風(fēng)類毒素（TT）等沒有毒性，但具有很好的佐劑作用

56、。,（一）霍亂毒素（CT）,霍亂毒素(CT)是良好的粘膜免疫原。CT是由A和B兩個區(qū)構(gòu)成的蛋白。B區(qū)具有主要免疫學(xué)作用，內(nèi)含5種獨立的非共價連接的B亞單位（CTB），無毒性，可與細胞結(jié)合。A區(qū)是CT的生物學(xué)活性部分，具有酶活性。它能提高對多種口服天然抗原的局部粘膜免疫力。 CT作為粘膜免疫佐劑的主要缺點是其本身具有毒性，天然CT不能用于人類，但可以用于動物。用戊二醛將仙臺病毒與CT結(jié)合，CT毒性降低1000倍，但仍有佐劑性質(zhì)。

57、,霍亂毒素（CT）,將CTB與流感病毒凝血素（HA）結(jié)合，免疫后發(fā)現(xiàn)，一個劑量的CTB-HA可產(chǎn)生高水平的IgA和IgG抗體，而兩個劑量的HA不能誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生。而抗體水平與抵抗致死性攻毒有關(guān)。鏈球菌表面蛋白與CTB結(jié)合后，可誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平的抗體。如不與CTB結(jié)合，要產(chǎn)生相同水平的抗體，則需100倍的抗原。CT毒素A和B兩個亞單位的表達質(zhì)粒DNA作為佐劑與DNA疫苗聯(lián)合應(yīng)用，還可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生很強的Th1細胞因子反應(yīng)（如IFN-γ）和

58、Th2細胞因子反應(yīng)（如IL-4），具有很強的佐劑作用。,大腸桿菌不耐熱毒素（LT）,大腸桿菌LT毒素有A和B兩個亞單位，有一定抗原性，但其毒性很強。通過基因工程點突變技術(shù)，使A亞單位上的一個氨基酸發(fā)生改變，表達的 則無毒性作用，但保留了其佐劑效應(yīng)。該表達產(chǎn)物可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生局部粘膜免疫反應(yīng)。利用基因突變技術(shù)，構(gòu)建的A和B兩個亞單位的表達質(zhì)粒DNA聯(lián)合應(yīng)用，可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生很強的Th1細胞因子反應(yīng)（IFN-γ）和Th2細胞因子反應(yīng)（IL-4

59、）。而且，LT毒素表達質(zhì)粒作為佐劑，可協(xié)助DNA疫苗誘導(dǎo)機體產(chǎn)生更強的細胞免疫反應(yīng)，有望成為一種新型免疫增強劑。,破傷風(fēng)類毒素（TT）,研究表明，TT也具有很強的佐劑效應(yīng)，特別是適合于多糖或小分子肽半抗原免疫。這些抗原經(jīng)偶聯(lián)結(jié)合到TT后，可誘發(fā)機體產(chǎn)生高水平的IgG抗體應(yīng)答。,四、其他新型免疫佐劑,（一）免疫刺激復(fù)合物（ISCOM）免疫刺激復(fù)合物（immunostimulating complex）是由抗原物質(zhì)與由皂樹皮提取的一種糖

60、苷Quil A和膽固醇按1：1：1混合后自發(fā)形成的一種具有較高免疫活性的脂質(zhì)小泡。ISCOM直徑40nm，每個ISCOM約含10～12分子的蛋白質(zhì)。ISCOM是一種全新的抗原遞呈系統(tǒng)，對機體有免疫增強作用，具有佐劑和抗原遞呈的兩重功效。應(yīng)用于多種細菌、病毒和寄生蟲病的疫苗，具有產(chǎn)生“全面”免疫應(yīng)答的效力，可長期增強特異性抗體應(yīng)答。另外，ISCOM能有效地通過粘膜給藥，從而可以用于抗呼吸道感染。目前，獸用ISCOM疫苗已在國外投放

61、市場。,1．ISCOMs的制備,目前，已有20多種病毒的親水脂蛋白(如外殼蛋白)以及若干種細菌和原生動物的膜蛋白被用于制備ISCOMs。制備時，首先用Triton、Tween、鏈烷基-N-甲基葡萄糖胺（MEGA）和葡萄糖辛酸酯（OG）等中性去垢劑將微生物裂解成分散的組分，并在形成ISCOMs的同時除去去垢劑。其方法有離心法和透析法。,2．ISCOM的作用機理,ISCOM是一種具有較高免疫學(xué)價值的新的抗原遞呈系統(tǒng)，其對輔助性T細胞、細胞毒

62、T細胞和B細胞都有活化作用,在抗原遞呈、抗原尋的和免疫調(diào)節(jié)的過程中都有作用，增強APC活性。ISCOM可增強機體對大多數(shù)抗原的體液免疫和遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)，調(diào)節(jié)MHCⅡ類抗原表達，刺激機體產(chǎn)生抗非感染性抗原的MHCⅠ類限制的CD8+細胞毒T細胞；,ISCOMs的作用機理,ISCOM作為吞噬性抗原，可直接通過MHCⅠ分子處理并提呈給T細胞，也可通過皂素與膜結(jié)構(gòu)相互鰲合到達胞質(zhì)。誘導(dǎo)特異性抗體及亞型產(chǎn)生，增強CD8+CTL應(yīng)答，提高MHCⅠ

63、分子在抗原提呈細胞的表達，誘導(dǎo)IL-1，IL-2及γ-IFN分泌，具有黏膜免疫活性。可激發(fā)細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，也可刺激體液免疫。還能克服母源抗體的封閉作用，通過黏膜途徑提呈抗原。是目前誘導(dǎo)CTL反應(yīng)最強的免疫刺激物。,（二）脂質(zhì)體佐劑,脂質(zhì)體（liposomes）是人工合成的具有單層或多層單位膜樣結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)小囊，由一個或多個類似細胞單位膜的類脂雙分子包裹水相介質(zhì)所組成，具有佐劑兼載體效應(yīng)。其作用方式主要是在抗原尋的中起作用。脂質(zhì)體的

64、結(jié)構(gòu)有利于將抗原遞呈給抗原處理細胞或其它免疫活性細胞。吞噬細胞吞噬脂質(zhì)體并破壞其膜結(jié)構(gòu)，釋放抗原并形成免疫復(fù)合物，有利于維持長時期的高效價抗體及產(chǎn)生免疫記憶。脂質(zhì)體在宿主體內(nèi)可以生物降解，本身無毒性，并且能降低抗原的毒性，無局部注射反應(yīng)。脂質(zhì)體與弗氏佐劑或氫氧化鋁膠混合使用，效果更佳。目前，脂質(zhì)體和ISCOM被認為是制備亞單位疫苗的理想載體和免疫佐劑。,（三）MF59佐劑,MF59佐劑由4.3％的角鯊?fù)椤?.5％的吐溫-80和0.5％

65、Span85組成。副反應(yīng)輕微，是除鋁鹽外，目前僅有的被批準(zhǔn)作為人用的免疫佐劑。在抗原中加入MF59佐劑的疫苗有很多種，如猿猴和人愛滋病病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、皰疹病毒和瘧疾原蟲抗原等，制成的疫苗常為O／W型。MF59不但可以刺激體液免疫，還可以激發(fā)細胞免疫。已進行了廣泛的實驗，人數(shù)超過8000，當(dāng)和HAS-2合用的1/2期臨床試驗中，產(chǎn)生的抗體量與使用鋁佐劑量相同，也同樣有較強的輔助T細胞應(yīng)答。,（四）生物降解微球（mic

66、rosphere）,用微球囊括抗原的可控制釋放系統(tǒng)，注射一針可以解決全程免疫問題。最成功和研究最多的抗原載體系統(tǒng)是聚脂類微球，可用于包裹激素、細胞因子、病毒顆粒及質(zhì)粒DNA等活性物質(zhì)。微球的內(nèi)部結(jié)構(gòu)：一種是貯存型（微囊），在聚合物形成的囊腔中包有抗原物質(zhì)。二是實體型（微球）抗原均勻分布于聚合物內(nèi)。這種效果更好，便于抗原釋放的控制?？乖尫庞袃煞N方式：脈沖式和持續(xù)式。后一種方式 可在相當(dāng)長的時間內(nèi)持續(xù)釋放抗原。,問題：,①微球材料需要用

67、有機金屬催化劑，殘留物的副作用。②微球制備時要用有機溶劑，也有殘留問題；③蛋白類等抗原物質(zhì)，遇有機物會發(fā)生變性，聚集等反應(yīng)。影響免疫效果。④口服疫苗要消毒，所用的γ射線對抗原有損傷，對微球有降解作用。⑤保存微球要凍干，但如何避免抗原不受影響？,（五）微生物,1、卡介苗：是巨噬細胞的激活劑，同時還能刺激骨髓的多功能干細胞發(fā)育成為免疫活性細胞，從而明顯提高機體的免疫力。是一種非特異性免疫增強劑。2、短小棒狀桿菌：經(jīng)加熱或甲醛滅活制

68、成。對機體毒性低，沒有嚴重的副作用。能非特異性刺激 淋巴樣組織增生，加強單核巨噬細胞的吞噬能力，加速抗原處理，增加抗體IgG,、IgM的生成。,3.單磷腺脂A（monophosphoryl lipid A,MPL）,LPS 是來自革蘭氏陰性菌的內(nèi)毒素，其佐劑效應(yīng)主要來自脂質(zhì)A。但由于其自身具有較大的毒性而無法作為人類疫苗的佐劑從一株沙門氏菌的細胞壁酸水解，從LPS中純化出脫毒的MPL產(chǎn)生的，是安全的免疫佐劑。能增強初次及再次免疫應(yīng)答