1、核酸疫苗,一、概 述,核酸疫苗又稱基因疫苗或DNA疫苗，就是把外源基因克隆到真核質粒表達載體上，然后將重組的質?；蛑苯用庖邫C體 ，使外源基因在活體內表達，產生的抗原激活機體的免疫系統(tǒng)，引發(fā)免疫反應。,（一）概 念,（二）DNA疫苗的構成： 1. 抗原表達基因 2. 真核細胞啟動子（如CMV I.E啟動子） 3. Poly A 終止序列（如來自SV40 或 BGH基因） 4. 原核細胞選

2、擇標志（如青霉素抗性基因） 5. 增強免疫原性的核苷酸序列（如非甲基化CpG二核苷),二、DNA疫苗載體,1. 裸DNA疫苗：質粒、 MIDGE載體2. 病毒載體： 天花病毒、腺病毒 3. 細菌載體：減毒活菌苗和繁殖缺陷細菌，如傷寒菌苗、腸炎沙門氏菌苗、志賀氏菌苗、單核細胞增生李斯特菌苗和小腸炎耶爾森氏菌苗4. 微粒包裹載體：金顆粒(gold particle)、脂質體(liposomes)、聚丙交酯-聚乙交酯（PLGA）

3、、藻酸鹽微粒(alginate)、和納米微粒(nanoparticles),Various methods of gene delivery,三、DNA疫苗與常規(guī)疫苗的比較,DNA疫苗與常規(guī)疫苗比較,DNA疫苗與常規(guī)疫苗比較(續(xù)1）,DNA疫苗與常規(guī)疫苗比較(續(xù)2）,核酸疫苗與第一、二代疫苗相比具有如下優(yōu)勢：,(1)誘導機體產生全面的免疫應答，其保護性免疫應答對不同亞型的病原體具有交叉抵御作用；(2)無減毒、滅活疫苗可能引起的致病作用

4、，具有可靠的安全性；(3)能表達經修飾的天然抗原，具有與天然抗原相同的構象和抗原性；(4)與亞單位疫苗共有的高產性；(5)可將編碼不同抗原的基因構建在同一個質粒中，或將不同抗原基因的多種重組質粒聯(lián)合應用，制備多價核酸疫苗；(6)核酸疫苗既有預防作用，也有治療作用；(7)生產簡便，成本低廉，穩(wěn)定性好，貯運方便。,四、核酸疫苗誘導的免疫反應,核酸疫苗誘導的全身免疫應答反應 關于核酸疫苗誘導全身免疫應答反應的機制目前了解的還

5、不十分清楚，但其誘導過程可大致分為以下幾個階段：①疫苗的攝取、轉運及表達；②抗原的加工和提呈；③淋巴細胞的活化；④免疫效應細胞和分子的作用。,Immune mechanisms induced by inoculation with naked DNA,Depiction of the mechanisms of generation of antigen-specific humoural and cellular respo

6、nses.,五、核酸疫苗的構建,1、將亞單位疫苗的編碼基因作為核酸疫苗的候選基因。 2、多肽合成疫苗的核酸推導序列作用核酸疫苗的候選基因 3、從病原體亞單位成分中篩選保護性抗原及編碼基因 3．1 免疫篩選法 3．2 化學分解法,候選基因的篩選原則,,,,Ligate PCR product into pTARGETTM Vector,,Transform TG1 cells,,Selecte recombinant clones

7、 by ampicillin,,pstⅠ酶切鑒定,挑取S基因正向插入的重組質粒pTARGET-hanS測序,,重組質粒pTARGET-hanS的構建:,引物1:CT ACT ATG GCA ACT ATG GAG GAA引物2:AC TAA TTA GAG TTT CAA AGG CTC,PCR,,,正向: 酶切成3674，1870，1470反向: 可酶切成3674，2600,740,,可酶切成5.6kb和1.3kb左右兩個片段,,

8、EcoRⅠ酶切,,瓊脂糖凝膠電泳,,回收5.6kb左右的大片段,對照空載體pTARGET的構建：,,用連接酶連接,成為閉環(huán)pTARGET空載體,作為對照載體備用。,培養(yǎng)Vero-E6細胞,,MEM培養(yǎng)基(10%FCS),37℃，5%CO2,細胞長至對數生長期,電穿孔轉染重組質粒,,轉染后72h，收獲細胞,,檢測核蛋白的瞬時表達,熒光顯微鏡下觀察并拍照。,間接免疫熒光法,重組質粒pTARGET-hanS體外瞬間表達:,,,核蛋白的瞬時表達

9、結果,,pcDNA3.1+S的酶切鑒定結果,1．pcDNA3.1+S 質粒（6.7kb）2．pcDNA3.1+S pstⅠ酶切 （5.0kb，1.7kb）3. pcDNA3.1+S（ISS）pstⅠ酶切,作為DNA免疫的注射樣品。,質粒的大量制備及純化:,按分子克隆手冊所述方法提純質粒pcDNA3.1+和 pcDNA3.1+S,,用滅菌的PBS溶解,,調整濃度至1.0mg/ml,用分光光度計測定A260/A280比值以確

10、定核酸樣品的純度，A260確定樣品的濃度,實驗動物的DNA免疫,6～8W 齡的BABC/c小鼠,,,空白質粒pcDNA3.1+,重組質粒pcDNA3.1+S,免疫前先用鹽酸布比卡因注射液預處理,,,,3天后,,相同部位進行DNA接種,加強免疫一次，共免疫3次。,間隔2周,,,細胞因子的動態(tài)變化,常規(guī)方法分離脾細胞，濃度1×107,,24孔細胞培養(yǎng)板每孔加入脾細胞懸液0.5ml，NP10?l(同時設空白對照孔， ConA刺激孔)

11、均設3個復孔,37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)48小時后,,收集脾細胞上清液，貯于-70℃，統(tǒng)一用ELISA kits 檢測IL-4和IFN-?,分別于免疫后5d, 10d, 17d, 35d,42d每組處死3只小鼠,淋巴細胞增殖反應:,脾細胞取自初次免疫后42d的免疫鼠,,以重組的核蛋白刺激免疫小鼠的脾細胞,,陰性對照孔和陽性對照孔(ConA),用MTT法檢測脾細胞的增殖反應，計算刺激指數（SI）,常規(guī)方法分離脾細胞,濃度調整至2×

12、;106,免疫鼠血清的抗NP抗體的測定:,免疫前和免疫后5d, 10d, 17d, 35d,42d經尾靜脈采血,,N=6/group,以被檢標本復孔（3孔）OD值與免疫前血清（陰性對照）的比值≥2.1者為陽性。,重組的NP作為包被物，辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG為二抗,ELISA法檢測血清的抗NP抗體,,血清抗NP抗體滴度的測定:,將初次免疫后42天的免疫鼠眼球取血,,N=6/group,留置血清，以10倍稀釋為起點,再做系列稀釋,

13、,ELISA法,檢測血清抗體滴度,六、核酸疫苗的優(yōu)化,1、免疫效果的優(yōu)化,選擇高效表達載體添加DNA免疫激活序列,,2、免疫途徑的優(yōu)化,肌肉注射（im）,基因槍導入,皮內(id)和皮下(sc)注射,黏膜表面接種,,Effects of CpG motifs on various cells,Generation of Immunity after Inoculation of DNA Plasmid with GpG Motifs,,

14、2、免疫途徑的優(yōu)化,3、基因佐劑的應用,細胞因子類共刺激分子分子佐劑聯(lián)合,,4、抗原蛋白的泛素化表達,IL-12、IL-15、IL-18及IFN-γ以增強Th1型細胞應答為主。 IL-4加強體液免疫,IL-2能同時加強體液免疫和細胞免疫 集落刺激因子,,5、與基因重組疫苗聯(lián)合應用,,,,細胞因子產生的動態(tài)變化,,,,細胞因子產生的動態(tài)變化,,免疫鼠脾細胞的增殖反應,,血清特異性抗體的檢測結果,血清特異性抗體的檢測結果,,,,S

15、,,B7,,,免疫鼠脾細胞的增殖反應,,,,免疫鼠脾細胞的增殖反應,,血清的抗NP抗體的測定結果,血清的抗NP抗體的測定結果,七、核酸疫苗的安全性問題,①局部反應原性和全身毒性研究，即考慮DNA疫苗是否有免疫毒性作用，機體是否對疫苗編碼的抗原產生耐受性，或是否導致自身免疫反應，還應對疫苗中污染的細菌蛋白是否誘發(fā)抗體產生進行評估；②遺傳性作用，即質粒DNA是否與宿主基因組的整合問題；③生殖毒性研究，可采用PCR方法對經質粒DNA疫苗免

16、疫的雄性或雌性動物的性腺DNA提取物進行檢測④致腫瘤性研究，如果質粒DNA疫苗構建具有與人的基因組同源的DNA序列，或其載體含有已知的潛在致癌基因序列時，需展開這方面的研究。,1、有關基因整合的研究,一個最重要的理論危機是質粒DNA與宿主基因組整合的問題，因為當外源DNA與基因組整合后，可能因插入活性癌基因、或活化宿主原癌基因、或使抑癌基因失活，或引起染色體斷裂，或染色體重排而致染色體不穩(wěn)定，從而導致腫瘤細胞形成。,尚無證據證明以自身

17、表達質粒的形式存在于染色體外的外源DNA能整合入宿主染色體中。 其整合發(fā)生率較自然整合發(fā)生率低3個數量級，另鮭魚精DNA已經以一種非處方藥形式經口服或注射等多種方式使用了數十年，卻未見任何明顯的副作用。,一些事實已清楚地證明脾內或口服裸DNA可能導致整合,2、關于免疫耐受的研究,外源性抗原的持續(xù)表達可能產生不良后果：耐受性、自動免疫、過敏反應、超免反應等。 持續(xù)低表達---可被抗體中和清除， 無

18、足夠的免疫應答。 持續(xù)高表達---超免反應發(fā)生—免疫抑制 —其它病原感染。,,免疫2天的小鼠產生耐受 免疫出生24小時內的小鼠，與在成年小鼠中觀察到的沒有區(qū)別。 HBsAg轉基因小鼠進行DNA免疫，使已經建立的對HBsAg的特異性免疫耐受狀態(tài)被打破，使小鼠產生抗HBsAg的特異性抗體。,實驗結果：,結論：免疫耐受與抗原類型、濃度、給藥方式及宿主種屬、宿主年齡等因素有關。,3、關于自身免疫性疾病的

19、研究,潛在性誘導抗質粒DNA的免疫反應是另一個必須關注的安全性問題。,研究表明： 用細菌DNA與mBAS及CFA形成的復合體免疫小鼠，能誘導小鼠產生與哺乳動物dsDNA發(fā)生反應的IgG自身抗體。 用各種構建的質粒載體進行的質粒DNA的免疫并未發(fā)現抗DNA抗體的產生。 DNA疫苗接種有自身免疫傾向的小鼠，重復給藥并沒有啟動或加重具有狼瘡傾向個體的疾病發(fā)生及發(fā)展過程。,4、其它不良反應,進行的Ⅰ期臨床試驗表明，未觀察到不可接受的不良反

20、應。,八、DNA疫苗的應用,（一）感染性疾病 （二）腫瘤 （三）自身免疫病與變態(tài)反應,表 病毒的DNA疫苗,表 病毒的DNA疫苗（續(xù)）,表 細菌的DNA疫苗,,表 寄生蟲的DNA疫苗,腫瘤抗原可被歸為四類：⑴ 個體腫瘤具有的獨特抗原⑵ 組織學相近腫瘤細胞具有的共同的抗原⑶ 組織分化抗原⑷ 正常細胞和腫瘤細胞均表達的抗原,DNA疫苗應用于腫瘤 DNA疫苗 腫瘤

21、 B細胞獨特型 淋巴瘤 Gp75/酪氨酸相關蛋白－1 黑色素瘤 MAGE,MART 黑色素瘤 前列腺表面抗原 前列腺癌 突變P53基因 P53基因突變引起的 腫瘤,,,,傳統(tǒng)免疫方法用于變態(tài)反應性疾病治療的特點:重復注射、劑量逐漸增加誘導IgG型封閉抗體引起變態(tài)

22、反應的危險療效不穩(wěn)定費用高、時間長被藥替代,DNA疫苗用于變態(tài)反應性疾病治療的特點： 主要誘導IgG2a抗體 可中和變應原 誘導較強的Th1應答 抑制抗原特異性IgE合成 和嗜酸性粒細胞的活化 不會引起變態(tài)反應

23、抑制炎癥反應,自身免疫病(多發(fā)性硬腫癥、類風濕性關節(jié)炎、Ⅰ型糖尿病),對微生物應答降低,針對自身組織T細胞活化,抗前炎癥介質抗體（少量),前炎癥介質（細胞因子、趨化因子）,產生量增加,炎癥，組織損傷,中和效應,炎癥反應、組織損傷減輕,DNA疫苗,,,,,,,,,,,有待進一步研究的問題： ◆ DNA疫苗目的基因的選擇 ◆ 目的基因的高效表達 ◆ 優(yōu)良載體的構建 ◆ 誘導適當免疫應答（個體中差異