1、朊病毒及其檢測,小組成員：石勇軍 費 鵬 閆 凱 王培培 嚴 姍 辛儒岱關亞飛 崔金紅,CONTENTS,,五、朊病毒的檢測,,1,,引言,傳染性海綿狀腦病(transmissible spongi-form encephalopathy, TSE)是一類致死性的神經系統(tǒng)退行性疾病。在哺乳動物中常見瘋牛病、羊瘙癢癥、貓海綿狀腦病以及傳染性水貂腦軟化病等；在人身上則發(fā)現(xiàn)了庫魯病、致死性家族失眠

2、癥、克-雅氏病以及格斯特曼綜合癥等?；疾〉娜撕蛣游?，大腦皮層的神經元細胞會發(fā)生進行性空泡化, 星形膠質細胞不斷增生, 造成灰質變薄而白質相對明顯,最后變成海綿狀態(tài)。,（左）病羊神經組織的海綿狀損傷。（右）病人大腦組織切片，海綿狀病變及周圍的沉淀斑,,2,,朊病毒的發(fā)現(xiàn),,3,,朊病毒引起的人類疾病,,4,,朊病毒引起的人類疾病,,,5,,疾病來源,,,6,,致病特點,PrPc PrPSc,α螺旋,β折疊

3、,,二者是異構體,由同一染色體基因PRNP編碼，其氨基酸序列完全一致,根本差別在于它們構象上的差異，PrPC分子中含42%的α螺旋，β折疊僅為3 %，而PrPSC的β折疊高達43 %，α螺旋為30 %。故一般認為，PrPSC是由于PrPC發(fā)生蛋白質錯誤折疊，一些α螺旋變構為β折疊，三維構象發(fā)生變化而產生的，同時帶來一系列理化性質的變化。,,4,,PrPC向PrPSC的轉化,（PrPSc的累積）,（PrP轉化為PrPSc),(PrP與Pr

4、PSc之間反應),（PrPc內生）,模型一 ：該模型是假定一個單一的PrPSC分子與一個單一的PrPC分子結合并催化其轉化成PrPSC。這兩個PrPSC分子,可以繼續(xù)轉換成PrPC。,(伸長),（構象變化),(破碎成多個部分),（感染）,模型二：假設PrPSC只是纖維，捆綁PrPC fibril，然后將其轉化成PrPSC，形成更長的纖維，這一現(xiàn)象可在染病毒致病中觀察到。,PrPC的功能,,1,,維持神經系統(tǒng)功能,在所有細胞類型中,以神經

5、元表達PrPC水平最高，且PrPC高度富集于突觸處(終板處也有富集)，這提示PrPC對神經系統(tǒng)有特殊的重要性。PrPC除實驗表明，PrPC缺失雖不引起肉眼可見的行為和發(fā)育障礙，但在整體動物水平來看可導致與晝夜節(jié)律有關的行為異常。在神經系統(tǒng)水平，PrPC缺失可導致電生理參數(shù)方面的改變。,有證據(jù)表明，在出現(xiàn)進行性運動失調癥狀PrPC缺失小鼠中，發(fā)現(xiàn)腦部嚴重萎縮，蒲肯野細胞異常，因PrPC缺失可能引起蒲肯野細胞過度興奮而導致小鼠死亡。PrP

6、C缺陷鼠還表現(xiàn)出對外源性銅和過氧化氫等應激誘導劑應答方面的改變。在細胞水平，PrPC缺陷鼠的神經元在培養(yǎng)時存活能力下降，且對銅和阿拉伯糖胞苷(AraC)等所導致的氧化損傷和毒性的敏感性增加；星形膠質細胞在攝取谷氨酸方面有異常；小膠質細胞對興奮物質的反應性下降；在突觸形成中有結構改變。由此可見，PrPC可能在一定程度上參與神經系統(tǒng)功能的維持。,,2,,參與神經組織的Cu2+代謝,PrPC作為腦組織中膜在銅結合蛋自參與神經組織中Cu

7、2+的穩(wěn)態(tài)平衡調節(jié)，當轉變?yōu)镻rPSC就失去結合Cu2+的能力，造成神經組織中Cu2+含量異常，導致神經細胞損傷。 Cu2+對不同神經細胞PrPC的影響也不相同。,,3,,抗氧化,PrPC通過與銅原子形成復合物而發(fā)揮抗氧化活性。PrPC借其八肽重復區(qū)最多可結合4個銅原子。結合后形成的復合物具有抗氧化活性，從而保護細胞免受氧化損傷。,,4,,參與淋巴細胞信號轉導,PrPC可高水平地在人T、B淋巴細胞、單核細胞及樹突狀細胞中表

8、達，不同細胞中表達PrPC的糖基組成、糖鏈形狀及蛋自酶解的敏感性都有差異。 T細胞的活化伴隨著其表而PrPC的表達上調，且PrPC在記憶T細胞比初始T細胞的表達水平高。,,5,,細胞凋亡,在PrP敲除小鼠神經元中，多種凋亡相關蛋自顯著增加，線粒體Ca2+含量改變、細胞色素c釋放，都表明PrP參與細胞凋亡調控過程。 體外試驗也顯示PrPC能夠保護人的神經元免受Bax誘導的細胞凋亡，而缺失八肽序列或C端帶有突

9、變的PrP均不具有該活性。,,6,,核酸代謝,Gabus等根據(jù)小鼠中瘟癢病的感染過程會因鼠自血病病毒（MuLV）的復制而加速，以及人類PrP功能上類似于NCp7，可輔助反轉錄酶合成前病毒DNA等現(xiàn)象，提出PrP可能參與了體內核酸代謝過程。,,,,致病機理,,1,,阮病毒學說,PrPC是一種膜蛋白，其C端含有23個氨基酸組糖基磷酸肌醇(GPI)錨受體結合位點，因此可通過糖基肌醇磷酸脂(glycoirmitol phosphohptds)聯(lián)

10、在膜上，定位于細胞膜的穴樣內陷類結構域（CLDs），在神經元，當膜漿膜上的PrPC變成為PrPSC后，PrPSC脫落并聚集在神經元的溶酶體。當達到數(shù)量，就可使神經元細胞破裂，形成神經組織的空泡化，并使星型膠質細胞增生，,,2,,“yeast prions”學說,,,3,,蛋白的氧化反應學說,楊池明提出了瘋牛病蛋白長壽命自由基即為瘋牛病中的亞病毒的理論設想，他認為真正的瘋牛病蛋白亞病毒可能是由蛋白的氧化反應所形成的瘋牛病蛋白自由基。

11、 應用此理論能夠解釋瘋牛病的一些病理現(xiàn)象。,,朊病毒的檢測,取組織標本,10個稀釋濃度,直到死亡或盲傳幾代,飼養(yǎng)24h,補接,,1,,動物的接種傳遞實驗,取標本,1. 前處理,2. 檢測,NC：硝酸纖維素膜,前處理品,免疫學檢測,取出NC膜,5-7μm薄片,收集在NC上,2mm厚切片,切片,55℃水浴,,2,,組織印記法,勻漿,離心,處理,顯色,最后酶標儀讀板,將腦組織置于8%的Zwittergent 3-12和0.5%十二烷

12、基肌氨酸鈉中,加入特異性一抗加入酶標二抗最后加入底物,用膠原酶、DNase I（脫氧核糖核酸酶I），蛋白酶K處理,收集富含PrPsc沉淀，將所得沉淀溶于3-4mol/L硫氰酸胍，包被酶標版,,3,,酶聯(lián)免疫吸附法,人工合成的PrPsc特異性肽鏈標記熒光,一定量的特異性抗體、羊腦提取物,標記的肽鏈與抗體結合后，遷移率發(fā)生改變,未與抗體結合的肽鏈，遷移率不變,當腦提取物中存在微量的PrPsc時,當腦提取物中不存在微量的PrPsc時,電泳

13、,,,,4,,毛細管凝膠電泳免疫測定法,,,,如何對非結晶型的朊病毒蛋白進行分子結構的準確分析，能否尋找一種方法，可以獲得朊病毒蛋白的準確的高級結構。,朊病毒的致病原因是PrPsc的過度增殖還是由于PrPc正常功能的缺失。,體外試驗產生PrPSC到底有無感染性，PrPSC的增殖是否需要其他輔助因子（如RNA）的參與。,科學家已經做了大量的關于朊病毒的研究工作，在許多方面取得了重要的進展，諸如PrPC與PrPSC的