1、本研究黃河鯉（Cyprinus carpio）為試驗(yàn)對(duì)象，在對(duì)黃河鯉金屬硫蛋白(Metallothionein，MT)基因的克隆及序列分析、黃河鯉MT基因的組織表達(dá)分析的基礎(chǔ)上通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）監(jiān)測(cè)分析水體銅脅迫下黃河鯉MT基因表達(dá)變化規(guī)律，以期從分子生物學(xué)角度為水體銅污染監(jiān)測(cè)提供新的分子標(biāo)志物。主要研究結(jié)果如下：
　　1、采用R

2、T-PCR方法成功克隆了黃河鯉MT基因的編碼區(qū)（Coding sequence，CDS）序列，全長(zhǎng)183bp，共編碼60個(gè)氨基酸，不含芳香族氨基酸和組氨酸，其中20個(gè)半胱氨酸（Cys）集中分布在肽鏈的氨基端（N-端）和羧基端（C-端），具有脊椎動(dòng)物MT典型的Cys-X-Cys、Cys-X-X-Cys、Cys-X-Cys-Cys保守序列結(jié)構(gòu)[1]，預(yù)測(cè)分子量為6013D，理論等電點(diǎn)為8.38。經(jīng)核苷酸多序列比對(duì)與高身鯽（Carassius

3、 cuvieri）同源性最高，為94％，氨基酸序列比對(duì)與稀有鮈鯽（Gobiocypris rarus）同源性最高，為95%。黃河鯉MT分子進(jìn)化親緣性與其生物學(xué)分類(lèi)地位基本一致。
　　2、依據(jù)獲取的黃河鯉MT基因片段合成高特異性的引物，采用優(yōu)化退火溫度及構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)提高引物擴(kuò)增效率，逐步摸索并成功建立了監(jiān)測(cè)黃河鯉MT基因表達(dá)水平的RT-qPCR的程序方法[2]。以β-actin為內(nèi)參，分析了黃河鯉MT基因的表達(dá)具有明顯的組織差異性，

4、其中肝胰臟MT表達(dá)量最高，其次是腎臟、腦和鰓，肌肉中最少，其中以肌肉組織MT基因的相對(duì)表達(dá)量為基準(zhǔn)單位―1‖，則肝胰臟的MT基因表達(dá)量為56，腎臟、腦和腮依次為16.6、7.9和3.4。
　　3、同時(shí)用0、0.10、0.30、0.60、1.0、1.5mg/LCu2+體外染毒刺激黃河鯉，采用PCR（RT-qPCR）監(jiān)測(cè)分析不同時(shí)間點(diǎn)（6h、12h、24h、48h、96h、192h、12d、16d）肝胰臟、腎臟、腮、肌肉和腦組織金屬硫

5、蛋白（MT）基因的表達(dá)量。結(jié)果表明，銅誘導(dǎo)下黃河鯉MT基因均表達(dá)上調(diào)且具有明顯的組織差異性：不同濃度間存在一定劑量-效應(yīng)關(guān)系，在誘導(dǎo)的前期（0-96h）存在一定的時(shí)間-效應(yīng)[3]；不同組織間MT基因上調(diào)量不同，其中肝胰臟最多，其次為腎臟、鰓和腦，肌肉上調(diào)最少，在整個(gè)誘導(dǎo)期除肝胰臟MT基因表達(dá)量不斷增加外，其他4個(gè)組織MT整體均呈先增高后下降的發(fā)展?fàn)顟B(tài)，但各個(gè)組織的誘導(dǎo)峰值及達(dá)到其誘導(dǎo)峰值的誘導(dǎo)時(shí)間不盡相同[4]；肝胰臟、腎臟、鰓、腦和肌