1、按大小分離按大小分離RNA:在含有甲醛的瓊脂糖凝膠上進行的在含有甲醛的瓊脂糖凝膠上進行的RNA電泳電泳1.試劑及其配制試劑及其配制1)甲醛（37%40%溶液，12.3molL）：配制100ml3740ml的甲醛溶液，加入DEPC處理的水定容到100ml。2)甲酰胺（去離子）3)10MOPS電泳緩沖液（1L）a)將41.8g的MOPS溶解于700ml滅菌的DEPC處理的水中，用2N的NaOH調整到pH值為7.0。b)加20mlDEPC處理

2、的1molL的乙酸鈉和20mlDEPC處理的0.5molLEDTA（pH=8.0），用DEPC處理的水將溶液的體積調整到1L。c)通過一個0.45um的微孔濾膜過濾滅菌溶液，同時，將其在室溫下避光貯存。4）RNALoadingBuffer(EB)：TaKaRa2配制含有2.2molL甲醛的瓊脂糖凝膠（100ml1.5%)1)稱量0.375g瓊脂糖到18ml滅菌水中用微波爐法溶解瓊脂糖，將溶液冷卻至55℃。2)加入2.5ml10MOPS電

3、泳緩沖液，4.5ml去離子甲醛，在化學通風櫥中灌制凝膠。3.處理樣品以及RNAmarker向4μl的RNA樣品（RNAmaker同理）中加入4μlRNAloadingbuffer，震蕩混勻厚稍離心，然后65℃水浴10min，速冷后即可使用。4.電泳電泳槽中加入1MOPS緩沖液，于4~5Vcm電壓下電泳，大約1h左右。變性變性RNA在膜上的轉移和固定在膜上的轉移和固定1轉移膠的制備：轉移膠的制備：1)用DEPC處理的水淋洗膠。2)將膠浸入

4、5倍體積的0.01molLNaOH3molLNaCl中20min。3)將凝膠轉移至一個玻璃干烤皿內，用鋒利的刀片修去凝膠的無用部分以保證膠與膜對齊。4)用長和寬均大于凝膠的玻璃板作為平臺，將其放在大干烤皿內，上面放一張濾紙。5)于干烤皿內倒入相應的轉移緩沖液（帶正電荷的膜用0.01molLNaOH3molLNaCl）直至液面略低于平臺表面，當平臺上方的濾紙完全濕透后，1)預雜交：預雜交液5ml預熱到42℃，將膜放入雜交瓶中，溫育膜2hr

5、。2)將預熱的42攝氏度雜交液5ml放入密閉的塑料袋中，加入探針約250ng（每ml雜交液中50ng探針），混勻。將預雜交后的膜轉移到密閉塑料袋中，42℃雜交過夜。洗膜洗膜1)雜交后，將膜迅速轉移至足夠的2SSC，0.1%SDS中連續(xù)震蕩兩次，每次5min。2)在68℃，用足夠的0.5SSC，0.1%SDS（提前預熱到洗滌溫度）連續(xù)震蕩兩次，每次15min。免疫檢測（地高辛雜交檢測試劑盒免疫檢測（地高辛雜交檢測試劑盒Ι）1制備試劑盒工作

6、液制備試劑盒工作液溶液組分制備阻斷液用順丁烯二酸緩沖液1:10稀釋10阻斷液，制備成1工作液抗體溶液每次使用前，需10000rpm離心抗DigAP酶結合物5min，從表面小心吸取所需的量。用阻斷液按1:5000稀釋抗體顯色底物液加200μlNBTBCIP到10ml檢測緩沖液中2步驟步驟1)在雜交和嚴謹洗滌之后，在洗滌緩沖液中浸潤5min。2)在10ml阻斷液中孵育30min。3)在10ml抗體溶液中孵育30min。4)在10ml洗滌緩沖