1、AFLP分子標記實驗分子標記實驗擴增片段長度多態(tài)性Amplifiedfragmentlengthpolymphism（AFLP）是在隨機擴增多態(tài)性（RAPD）和限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）技術上發(fā)展起來的DNA多態(tài)性檢測技術，具有RFLP技術高重復性和RAPD技術簡便快捷的特點，不需象RFLP分析一樣必須制備探針，且與RAPD標記一樣對基因組多態(tài)性的檢測不需要知道其基因組的序列特征，同時彌補了RAPD技術重復性差的缺陷。同其他以PC

2、R為基礎的標記技術相比，AFLP技術能同時檢測到大量的位點和多態(tài)性標記。此技術已經(jīng)成功地用于遺傳多樣性研究，種質(zhì)資源鑒定方面的研究，構建遺傳圖譜等。其基本原理是：以PCR(聚合酶鏈式反應)為基礎，結合了RFLP、RAPD的分子標記技術。把DNA進行限制性內(nèi)切酶酶切，然后選擇特定的片段進行PCR擴增(在所有的限制性片段兩端加上帶有特定序列的“接頭”，用與接頭互補的但3端有幾個隨機選擇的核苷酸的引物進行特異PCR擴增，只有那些與3端嚴格配對

3、的片段才能得到擴增)，再在有高分辨力的測序膠上分開這些擴增產(chǎn)物，用放射性法、熒光法或銀染染色法均可檢測之。一、一、實驗材料實驗材料采用青稞葉片提取總DNA。二、二、實驗設備實驗設備1.美國貝克曼庫爾特CEQ8000毛細管電泳系統(tǒng)，2.美國貝克曼庫爾特臺式冷凍離心機，3.美國MJ公司PCR儀，4.安瑪西亞電泳儀等。三、三、實驗試劑實驗試劑1.試劑：請使用高質(zhì)量產(chǎn)品，推薦日本東洋坊TOYOBO公司的相關產(chǎn)品。DNA提取試劑盒；EcI酶Mse

4、I酶，T4連接酶試劑盒；Taq酶，dNTPPCRreactionbuffer；AFLP引物；瓊脂糖電泳試劑：瓊脂糖，無毒GeneFinder核酸染料替代傳統(tǒng)EB染料；超純水（18.2MΩcm）2其他實驗需要物品微量移液槍（一套）及相應尺寸Tip頭PCR管冰浴等。四、四、實驗流程實驗流程1、總DNA提取提取使用DNA提取試劑盒提取植物基因組DNA，通過紫外分光光度計檢測或用標準品跑膠檢測。一般來說，100ng的基因組DNA作為反應模板是足

5、夠的。2、Ec1酶消化酶消化（20ul體系樣品）Ec11ul(10Uul)10Buffer2ul37℃2hrs65℃30min終止反應sample(總DNA)5ulddH2O12ulSample3ul(稀釋10倍)四、實驗結果與分析四、實驗結果與分析本實驗使用貝克曼庫爾特（BeckmanCoulter）公司CEQ8000遺傳分析系統(tǒng)，運用先進的熒光標記技術和毛細管電泳分離技術進行實驗，擴增產(chǎn)物在高分辨率毛細管中電泳分離，采用激光激發(fā)熒光