1、不同固定液對細胞骨架熒光染色標記效果的影響羅果，保玉心，李晉（563003貴州遵義，遵義醫(yī)學院中心實驗室）[摘要]目的目的比較不同固定液對細胞骨架熒光染色的差異，選擇最佳固定方法。方法方法分別采用4%甲醛、2%戊二醛、95%乙醇和4%多聚甲醛MES4種固定液，對人肺腺癌細胞H1299進行固定，對其微管和微絲熒光標記后，在共聚焦顯微鏡下觀察其形態(tài)結構。結果結果4%多聚甲醛MES對細胞的微管和微絲都有很好的固定作用。4%甲醛、2%戊二醛、9

2、5%乙醇對細胞的微絲基本能起到固定作用，而4%甲醛對微管的固定效果略差，2%戊二醛、95%乙醇固定的細胞看不到微管的具體形態(tài)結構。結論結論細胞骨架的固定中需加入骨架穩(wěn)定劑，且根據實驗目的，選擇適當?shù)墓潭ㄒ韩@得最佳標記效果。[關鍵詞]細胞骨架；激光共聚焦顯微鏡；H1299細胞；熒光染色[中圖法分類號][文獻標志碼]B激光共聚焦顯微鏡是研究細胞骨架的最佳儀器[1]。從形態(tài)觀察、定位、定量到分子結構與功能調節(jié)以及病理變化等各方面對細胞骨架進行

3、研究，成為現(xiàn)代生物醫(yī)學中重要課題[24]。共聚焦樣本的制備包括樣本的預處理和熒光標記2個主要步驟，樣本制備的好壞直接決定實驗的成功與否。MES是一種具有較高去污力的表面活性劑，生物溶解性能好，工業(yè)上常用于液體洗滌中作活性物、分散劑等，在細胞生物領域中常用作某些組織結構的穩(wěn)定劑，本實驗中采用4種常用細胞固定液，同時結合2(N嗎啉基)乙磺酸（MES），分別固定人肺腺癌細胞H1299，并對其微管和微絲進行熒光標記，通過激光共聚焦圖像的觀察和分

4、析，探討不同固定液對細胞骨架的影響，選擇最佳固定方法。1材料與方法1.1材料、試劑和儀器人肺腺癌細胞系H1299：由我校生化教研室范芳副教授惠贈。DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司)，胎牛血清(四季青生物公司)，PhalloidinTRITC(Sigma公司)，鼠抗人βtubulin(USBiological公司)，羊抗鼠IgGFITC(SantaCruz公司)，多聚甲醛(Sigma公司)，MES(Solarbio公司)，TritonX10

5、0(Solarbio公司)。激光共聚焦顯微鏡(LeicaSP2)，二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo公司)超凈工作臺(蘇州凈化)。1.2H1299細胞培養(yǎng)復蘇液氮凍存的H1299細胞，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，接種于細胞培養(yǎng)瓶中，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，0.25%胰酶消化傳代。取對數(shù)生長期的細胞用胰酶消化成單個，調整細胞濃度為2?104ml，接種于Petri皿中，培養(yǎng)12h，待其貼壁后用于實驗。1.3H1299細胞的固定

6、取出Petri皿，分別用4%甲醛、2%戊二醛、95%乙醇和4%多聚甲醛MES對Petri皿中的細胞進行固定，具體方法[59]如下：①4%甲醛固定：Petri皿中的細胞用PBS沖洗3次，用4℃預冷的4%甲醛室溫固定20min②2%戊二醛固定：Petri皿中的細胞用PBS沖洗3次用2%戊二醛室溫固定15min，再用1gL的NaBH4洗3次，每次4min③95%乙醇固定：Petri皿中的細胞用PBS沖洗3次，用95%乙醇室溫固定30min；④

7、4%多聚甲醛MES固定：Petri皿中的細胞用37℃預熱的MES(MES90mmolLMgCl22mmolLEDTA1.5mmolLPEG80005mmolL)沖洗3次，用4%多聚甲醛MES室溫固定20min，再用37℃預熱的MES沖洗3次。1.4間接免疫熒光法標記細胞微管將固定好的細胞用0.5%TritonPBS洗滌3次、每次10min，加入鼠抗人βtubulin，37℃孵育1h，再用0.5%TritonPBS洗滌3次、每次10min

8、，加入羊抗鼠IgGFITC，37℃孵育1h，用0.5%TritonPBS洗滌3次、每次10min[10]。1.5直接標記法標記細胞微絲向標記好微管的細胞中直接加入PhalloidinTRITC，室溫孵育15min，再用PBS洗3次，每次10min。最后向Petri皿中滴加90%甘油PBS，激光共聚焦顯微鏡掃描成像，物鏡用63倍油鏡，圖片標尺長度為20μm。2結果2.1用4%甲醛固定法的H1299細胞骨架形態(tài)觀察用4%甲醛固定的H1299

9、細胞，進行熒光標記后，微管結構隱約可見，層次不清晰，且細胞胞漿中非特異熒光較強，整個圖片的背景噪聲較高(圖1A）；微絲呈現(xiàn)清晰的束狀纖維，層次清晰，立體感較強(圖1B）；圖像疊加之后的兩種熒光有竄色現(xiàn)象，微管和微絲共定位不清晰，2種結構較難區(qū)分清楚(圖1C）。架進行很好地固定，導致觀察不到清晰的細胞骨架結構，因而需要加入一些輔助試劑，如穩(wěn)定骨架結構的試劑MES，使細胞骨架在細胞脫離培養(yǎng)環(huán)境的時候不易發(fā)生解聚，達到穩(wěn)定骨架以及固定作用。綜

10、上所述，不同固定劑的固定原理不同，對細胞成分、蛋白、結構等的固定效果也有差異。在不同的實驗中，應根據實驗目的選擇合適的固定劑和輔助試劑，以達到最佳固定效果。參考文獻：[1]袁聿軍.細胞骨架的基本成分與功能[J].生物學教學200631(4):58.[2]周永紅陳利國屈援等.2型糖尿病患者血清對人臍靜脈內皮細胞骨架及胞漿內游離鈣的影響[J].中國老年學雜志200929(15):18651867.[3]曹小紅王愛華王春玲等.Surfacti

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