1、本論文以16S rRNA為分子標記，分別以克隆文庫法和高通量測序法探討克拉瑪依油田石油污染土壤中細菌群落多樣性和系統(tǒng)發(fā)育，并分析環(huán)境因子與群落分布的關系，為生物處理石油污染物提供理論基礎。
　　在克拉瑪依油田分別采集離地面5、20、50 cm的石油污染土壤樣品，測定環(huán)境參數(shù)；提取石油污染土壤細菌群落基因組DNA，分別構建三個土層細菌16S rRNA基因文庫，利用限制性片段長度多態(tài)性分析(Restriction Fragment L

2、ength Polymorphisms RFLP)技術初步分群，確定各文庫中的代表菌株并測定16S rRNA基因序列；利用軟件Biodap計算各群落多樣性和豐富度指數(shù)，以Neighbor-joining法構建三個土層細菌的系統(tǒng)發(fā)育樹；運用程序CANOCO結合不同樣品理化性質的差異進行典型對應分析(CCA)，并探討了土壤理化性質對細菌群落結構的影響。高通量測序法用稀釋后的土壤總DNA為模板，利用16S V4區(qū)515F和806R做引物，進行

3、PCR擴增，構建文庫，利用Hiseq2500進行上機測序，研究石油污染土壤細菌多樣性。
　　環(huán)境參數(shù)結果表明20 cm土層總磷(TP)、總氮(TN)值最低，50 cm值最高；5 cm土壤里有機碳(TOC)的值最高，50 cm的值最小。基于16S rRNA序列的生物多樣性和細菌豐富度值表明20 cm土層生物多樣性和豐富度值較高，而50 cm土層各項指數(shù)均較低。各土層供試序列RFLP聚類分析表明，克拉瑪依油田石油污染土層微生物種群的豐

4、度值較高。Neighbor-joining建立的系統(tǒng)發(fā)育結果表明，石油污染土壤被分為5大類，分別為變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、厚壁菌門(Firmicute)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、浮霉狀菌門(Planctomycetes)。高通量測序法結果表明，三層土壤樣品中所含的優(yōu)勢細菌類群大致相同，分別為變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobact

5、eria)、厚壁菌門(Firmicutes)。3個樣品的Chao指數(shù)和Shannon指數(shù)均較大，其中20 cm土樣的豐度最高多樣性豐富，5 cm土樣其次,50 cm土樣相對較低。3個土壤樣品文庫覆蓋率都達到99％以上，說明本研究中各樣品文庫包含了大多數(shù)細菌類群，能夠充分反映土樣中細菌類群分布特征及豐富度。在門分類水平，三層土壤主要菌門是變形菌門(Proteobacteria)，屬分類水平三層土壤共有的最主要菌屬是海桿菌屬(Marinob

6、acter)。CCA分析石油污染土壤環(huán)境因子與細菌類群之間的關系，分析可得TOC、TP和TN含量是改變細菌類群分布特征的重要因素。
　　克隆文庫法與高通量測序法在反映樣本中優(yōu)勢細菌類群的結果基本相同，而在反應石油污染土壤微生物群落規(guī)模上差異較大。就Shannon指數(shù)和Simpon指數(shù)反映的結果顯示，高通量測序優(yōu)于克隆文庫，即高通量測序比克隆文庫更能較客觀反映石油污染土層里細菌菌群結構的真實信息。
　　兩種方法測試結果表明石油