1、堆肥是修復石油污染土壤的重要技術之一。微生物在堆肥過程中對石油的降解起著關鍵作用，然而，鑒于土壤微生物的復雜性和不同生態(tài)條件下土壤微生物群落的差異性，目前對于石油污染土壤堆肥（尤其是強化堆肥）中的微生物群落結構以及強化降解機制的研究還十分有限。本研究從大慶石油污染土壤中分離篩選高效石油烴降解菌群和鼠李糖脂表面活性劑產生菌，在此基礎上研究不同堆肥方式（自然堆肥、表面活性劑強化堆肥和復合菌群強化堆肥）對大慶石油污染土壤中石油的降解情況，采用

2、16s rDNA高通量測序技術檢測堆肥過程中微生物群落結構，分析石油烴降解過程與微生物群落之間的關系;構建AlkB（烷烴單加氧酶）功能基因克隆文庫，分析堆肥各時期烴降解功能微生物的多樣性和結構變化;對AlkB基因進行熒光定量PCR檢測，研究烴降解功能菌群的數(shù)量、活性特征與石油烴降解過程之間的關系，研究揭示了堆肥過程中石油降解的微生物生態(tài)學機制，為大慶油田及其他油田石油污染土壤的堆肥修復提供理論依據(jù)。論文的主要研究結果如下:
　　(

3、1)從大慶油田石油污染土壤與牛糞、秸稈的堆肥體系中分離篩選到耐高溫石油降解菌群wt-3，通過16S rDNA鑒定，該菌群優(yōu)勢屬為芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、紅球菌屬、假黃單胞菌屬和賴氨芽孢桿菌屬。wt-3降解石油的最佳條件是:培養(yǎng)溫度45℃、初始pH為7.0、接種量3％、搖床轉數(shù)160r/min、培養(yǎng)基石油濃度2％，此條件下最高降解率為75.3％。柱層析分析表明，wt-3對原油組分中飽和烴、芳香烴、瀝青質和膠質的降解率分別為83％、50％、

4、25％和30％，說明該復合菌群能夠有效的降解石油污染物。
　　(2)從大慶石油污染土壤中篩選篩選到一株高產表面活性劑的菌株wk-4，經(jīng)生理生化及16S rDNA鑒定確定該菌株為銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）。該菌株的產表面活性劑的最優(yōu)發(fā)酵條件為:碳源豆油10 g/L、氮源氯化銨5g/L、發(fā)酵時間120 h時，此條件下糖脂類表面活性劑的產量可達0.81 g/L，在已有報道文獻中產量較高。經(jīng)薄層層析法確定

5、該表面活性劑為糖脂類表面活性劑，硅膠柱純化后收集得到單雙鼠李糖脂兩種組分。該鼠李糖脂產物臨界膠束濃度為50mg/L，鹽濃度耐受范圍為0％-6％，pH耐受范圍為3.0-12.0，適宜溫度范圍為20℃-100℃，可應用于堆肥處理中。在石油污染土壤的原位修復試驗中，添加3CMC濃度鼠李糖脂的土壤樣品降解率最高，降解率為67.4％
　　(3)三種堆肥方式均可有效降解總石油烴(TPH)，強化堆肥（表面活性劑強化堆肥和復合菌群強化堆肥）降解效

6、率高于自然堆肥。在42天堆肥結束時自然堆肥、表面活性劑強化堆肥和復合菌群強化堆肥中TPH降解率分別為69％88％和80％，降解半衰期為23d、14d和18d。堆肥過程中，強化堆肥各時期細菌數(shù)量均明顯高于自然堆肥，細菌的數(shù)量級達到109CFU/g，而自然堆肥中細菌的數(shù)量級為108CFU/g，同時，強化堆肥中高溫期持續(xù)11d以上，自然堆肥中高溫期僅持續(xù)7d，這表明強化堆肥均可通過促進微生物的代謝和繁殖來提高石油污染物的降解速率。TPH測定結

7、果還表明:不同堆肥方式中烴降解的規(guī)律不同，自然堆肥中腐熟期TPH降解速度最快，表面活性劑強化堆肥中降溫期TPH降解速度最快，而復合菌群強化堆肥中TPH降解最快時期出現(xiàn)在高溫期，但三種堆肥方式中石油降解過程均符合一級反應動力學方程。GC-FID分段分析表明，兩種強化堆肥可降解的原油優(yōu)勢組分不同，表面活性劑強化堆肥中對烷烴的降解更有利，復合菌群強化堆肥中對芳香烴類的降解更有利。
　　(4)細菌16SrDNA高通量測序分析表明，三種不同

8、方式的堆肥中微生物群落豐富度和多樣性變化趨勢一致，即高溫期微生物群落豐富度和多樣性最少，進入降溫期和腐熟期逐漸增加，而且在整個堆肥過程中兩種強化堆肥中微生物群落豐富度和多樣性均高于自然堆肥。在堆肥中降溫期和腐熟期，表面活性劑強化堆肥Simpson指數(shù)分別為5.22和5.48，復合菌群強化堆肥Simpson指數(shù)分別為5.10和5.26，均高于自然堆肥（4.98和5.12）。聚類分析表明，三種方式堆肥中高溫期和降溫期細菌群落組成結構差異顯著

9、，而腐熟期細菌群落組成結構相似。測序結果表明三種方式堆肥中的細菌屬于28個門，其中5個優(yōu)勢菌門為Proteobacteria、Firmicutes、 Bacteroidetes、 Chloroflexi、Actinobacteria。在綱水平上屬于21個綱，其中9個優(yōu)勢綱為Bacilli、Actinobacteria、γ-Proteobacteria、α-Proteobacteria、 Anaerolineae、 Cytophagia、

10、Flavobacteriia和Clostridia。在屬水平上對豐度前40的屬統(tǒng)計分析，其中與石油烴降解有關的菌屬有12個。自然堆肥中豐度較高的烴降解菌屬為Rhodococcus sp.、Bacillus sp.和Steroidobacter sp.，顯著性分析表明，TPH降解速率與Rhodococcus sp.和Steroidobacter sp.呈顯著正相關(P＜0.05);表面活性劑強化堆肥中豐度較高的烴降解菌為Pseudomon

11、as sp.、Flavobacterium sp.、Pusillimonas sp.和Mycobacteriu sp.，TPH降解速率與Pseudomonas sp.和Flavobacterium sp.呈顯著正相關(P＜0.05)，同時與Pusillimonas sp.正相關性較大;復合菌群強化堆肥中豐度較高的烴降解菌為Pseudomonas sp.、Bacillus sp.、Lysinibacillus sp.和Gordonia s

12、p.，TPH降解速率與Pseudomonas sp.顯著正相關(P＜0.05)，與Gordonia sp.顯著負相關(P＜0.05)。
　　(5)建立了堆肥樣品的AlkB基因克隆文庫，共得到466條序列，分析獲得12個OPFs。AlkB的α多樣性分析表明，兩種強化堆肥中的AlkB基因多樣性均高于自然堆肥。不同堆肥方式中優(yōu)勢OPF不同，自然堆肥中OPF6（相似序列Rhodococcus erythropolis AlkB）和OPF2

13、（Rhodococcus qingshengii BKS20-40 AlkB）為優(yōu)勢OPF，表面活性劑強化堆肥中優(yōu)勢OPF為OPF12(Flavobacteriales bacterium ALC-1 AlkB)和OPF8(Pseudomonas aeruginosa AlkB),復合菌群強化堆肥中OPF5（Pseudomonas sp.D86 AlkB）為優(yōu)勢OPF，三種堆肥方式中優(yōu)勢OPF的最相似菌屬均與16SrDNA高通量測序時與