1、歡迎大家參加我的開題報(bào)告,氨基酸螯合鋅和維生素E互作對(duì)肉仔雞生長(zhǎng)、免疫和抗氧化功能的影響,一、論文選題意義 1、科學(xué)和實(shí)踐意義 2、國內(nèi)外研究動(dòng)態(tài) 3、創(chuàng)新和特色,,,1 科學(xué)和實(shí)踐意義 隨著畜牧業(yè)的發(fā)展，飼料中礦物元素和維生素添加劑的應(yīng)用日益普遍，與此同時(shí)，由于不了解礦物元素與維生素互作而產(chǎn)生的資源浪費(fèi)、環(huán)境污染等問題也日益嚴(yán)重，因此，對(duì)礦物元素與維生素互作的研究具有很重要的意義。

2、 VE和微量元素Zn作為肉雞維持健康、正常生長(zhǎng)發(fā)育、免疫所必需的微量營養(yǎng)成分，在肉雞生產(chǎn)中起著極其重要的作用。但是以前的研究只注重于單一養(yǎng)分的添加效果的探討，對(duì)于鋅和VE互作在肉雞生長(zhǎng)、免疫中作用的研究很少，而氨基酸螯合鋅與VE互作的報(bào)道更少，所以，我們有必要進(jìn)行更進(jìn)一步的研究。 本試驗(yàn)通過給予肉仔雞不同劑量的氨基酸螯合鋅和VE，探討鋅與VE互作對(duì)肉雞生長(zhǎng)、免疫和抗氧化功能的影響，并根據(jù)生長(zhǎng)、免疫

3、等指標(biāo)確定Zn-AA與VE同時(shí)添加時(shí)的適宜量，為今后生產(chǎn)中進(jìn)一步合理利用氨基酸螯合鋅和VE，以及肉仔雞日糧的合理配制提供科學(xué)依據(jù)。,2 國內(nèi)外研究動(dòng)態(tài)VE對(duì)生長(zhǎng)、免疫抗氧化功能的研究進(jìn)展,許多研究均已證明VE有促生長(zhǎng)的作用，給肉雞日糧中添加VE可以提高日增重和料肉比，從而提高其生產(chǎn)性能（Morrissey等1997；藺志剛等2004；李紹鈺等2005）。VE也可以影響免疫系統(tǒng)(Meydani等1989)。一方面，可以增強(qiáng)機(jī)體的體液免

4、疫（Morandi等1993）。另一方面，也提高淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率和數(shù)量，提高細(xì)胞免疫能力（C. Lauridsen等2005；孫尼，2004）。VE還可以提高機(jī)體抗氧化力。機(jī)體缺乏VE時(shí)，不僅會(huì)干擾肉雞正常的免疫反應(yīng)Gore等1997；王文君2002)，而且機(jī)體的抗氧化能力也下降了（ J. E. Oldfield等2003； T. L. Toepfer-Berg等2004）。,氨基酸螯合鋅對(duì)生長(zhǎng)、免疫、抗氧化研究進(jìn)展,肉雞日糧中添加蛋

5、氨酸鋅時(shí)，以增重、采食量和飼料轉(zhuǎn)化率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，能促進(jìn)生長(zhǎng)，而且添加效果在前、中期優(yōu)于后期（Aeda等2002；K．Sahin等2005) 。氨酸螯合鋅在增強(qiáng)肉雞免疫和抗應(yīng)激方面也有一定的作用（Dardeune等 1993；K．Sahin2005）一方面主要是通過提高血清中IgG含量，增強(qiáng)機(jī)體的體液免疫功能(Ahn等1998)，另一方面，也可以提高淋巴細(xì)胞的免疫活性，從而提高細(xì)胞免疫力（Kidd 1992，1994），降低發(fā)病率和死亡

6、率(Dudley-cash 1997；Christ等2000）。肉雞缺鋅，肝臟、脾臟、法氏囊和胸腺中Cu,Zn-SOD、GSH-Px的活性明顯下降(張日俊1996)、機(jī)體抗氧化力下降（Salgueiro2000；Zago等2001），血清鋅含量降低、AKP活性降低(Kraus等1997)、MDA含量顯著升高 (周麗英等1999)。但是日糧高鋅可使雛雞免疫功能受損(崔恒敏等2005)。,鋅和VE對(duì)生長(zhǎng)、免疫抗氧化研究進(jìn)展,Dove和Ev

7、ans(1981)報(bào)道畜禽飼料中添加高水平的Zn、Mn可增加VE的損失。Sahin和Kucuk（2003）報(bào)道豬飼料中添加VE和鋅對(duì)環(huán)境應(yīng)激有改善作用。孫尼（2004）認(rèn)為飼料中含高水平的鋅與銅可增加雞對(duì)缺乏維生素E癥狀的易感性。張維睿等(2005)認(rèn)為微量元素氨基酸螯合物可防止維生素的破壞。,3 創(chuàng)新和特色,提出鋅（氨基酸螯合鋅）和VE互作對(duì)肉仔雞生長(zhǎng)性能、免疫機(jī)能和抗氧化功能的影響。 比較肉仔雞不同生長(zhǎng)階段（0-3w，4-7

8、w），鋅和VE互作對(duì)其生長(zhǎng)性能、免疫機(jī)能和抗氧化功能的影響。了解微量元素鋅與VE的協(xié)同或頡抗作用。,二、研究?jī)?nèi)容、預(yù)期達(dá)到的目標(biāo)及擬解決 的關(guān)鍵問題 1、研究?jī)?nèi)容及預(yù)期達(dá)到的目標(biāo) 2、擬解決的關(guān)鍵問題,1 研究?jī)?nèi)容及預(yù)期達(dá)到的目標(biāo),本研究以0-7周齡肉仔雞為研究對(duì)象，通過飼養(yǎng)試驗(yàn)，探討氨基酸螯合鋅與VE互作對(duì)肉仔雞生長(zhǎng)性能、免疫和抗氧化功能的影響，為現(xiàn)今生產(chǎn)中提供理論依據(jù)。本研究以0-7周齡肉仔雞

9、為研究對(duì)象，通過同時(shí)添加氨基酸螯合鋅和VE，探討鋅和VE之間是否存在頡抗或協(xié)同。本研究通過兩個(gè)實(shí)驗(yàn)階段（0-3w，4-7w），比較不同階段鋅和VE互作對(duì)肉仔雞生長(zhǎng)、免疫和抗氧化功能的影響。本研究以0-7周齡肉仔雞為研究對(duì)象，根據(jù)生產(chǎn)性能免疫機(jī)能和抗氧化指標(biāo)結(jié)果，篩選出維持肉仔雞生長(zhǎng)性能以及免疫功能和抗氧化功能最佳的VE和鋅水平。,2 擬解決的關(guān)鍵問題,日糧中氨基酸螯合鋅與VE互作對(duì)肉仔雞生長(zhǎng)性能的影響；日糧中氨基酸螯合鋅與VE互作

10、對(duì)肉仔雞免疫功能的影響；日糧中氨基酸螯合鋅與VE互作對(duì)肉仔雞抗氧化功能的影響。,三、研究方法和技術(shù)路線1. 擬采取的研究實(shí)驗(yàn)方法、步驟、技術(shù)路線及可行性論證2. 研究工作的總體安排及進(jìn)度,1. 擬采取的研究實(shí)驗(yàn)方法、步驟、技術(shù)路線及可行性論證 1.1 實(shí)驗(yàn)方法及實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 1.2 飼養(yǎng)管理 1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法 1.4 實(shí)驗(yàn)步驟 1.5技術(shù)路線及可行性論證,,1.1 實(shí)驗(yàn)方法及實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 本

11、試驗(yàn)選用1日齡健康的艾維茵肉仔雞300只（公母各半）采用3×3（Zn×VE）二因子完全隨機(jī)化設(shè)計(jì)，隨機(jī)分為10個(gè)處理，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10只雞。試驗(yàn)期為期7周。試驗(yàn)日糧為玉米一豆粕型日糧，參照NRC（1998）肉雞營養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)。 對(duì)照組為基礎(chǔ)日糧，試驗(yàn)組日糧是根據(jù)基礎(chǔ)日糧中維生素和微量元素的含量和以前有于添加量的研究結(jié)果，在基礎(chǔ)日糧基礎(chǔ)上添加： 蛋氨酸鋅水平為10、50、100mg/kg（以鋅計(jì)）；

12、維生素E為5、10、100IU/kg（具體設(shè)計(jì)見表1）。,表1試驗(yàn)設(shè)計(jì),注：鋅為蛋氨酸螯合鋅，VE為VE醋酸酯,1.2 飼養(yǎng)管理 試驗(yàn)雞，按照該品種雞管理手冊(cè)管理。保證自由采食與飲水。 1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法（1）生長(zhǎng)性能有關(guān)指標(biāo)：各重復(fù)組分別在3、5、6和7周齡末測(cè)定兩階段雞體重，統(tǒng)計(jì)耗料量，和各組雞死亡數(shù)，計(jì)算增重、料肉比。（2）T淋巴細(xì)胞百分?jǐn)?shù)：采用α-醋酸萘酯染色法[1] 。（3）免疫器官指數(shù)（g/kg）=免疫器官鮮重

13、/體重,（4） 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率：采用淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)[2]。（5）NDV抗體效價(jià)：采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)[3]測(cè)定。（6）血清銅鋅超氧化物歧化酶（Cu,ZnSOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）血清銅藍(lán)蛋白(CP) 和血清丙二醛（MDA）都由南京建成生物工程研究所提供的試劑盒測(cè)定。（7）組織器官鋅濃度組織器官鋅濃度：準(zhǔn)確稱取烘干粉碎后樣品2.0000克于30毫升坩堝中，在電爐上炭化至無煙，冷卻，然后置于500-550℃高溫電

14、爐中灰化8小時(shí)，冷卻后，加1mol/L的硝酸2ml35℃烘箱過夜，再轉(zhuǎn)移到50ml容量瓶中，定容，用原子吸收分光光度計(jì)測(cè)定。,1.4實(shí)驗(yàn)步驟 試驗(yàn)期49天。分兩個(gè)階段，第一階段為0~3周齡，第二階段為4~7周齡。分別在7、14日齡接種NDV疫苗，并檢測(cè)相應(yīng)抗體效價(jià)。 1.4.1樣品的采集和制備 分別在3、5、6、7w末采集（公母比例相同）血樣。從每個(gè)重復(fù)內(nèi)隨機(jī)抽取接近平均體重的雞各兩只，心臟采血。制備全血和血清。最后一次采血并

15、稱重后，將雞屠宰，去毛，稱屠體重，然后將法氏囊、胸腺、脾臟分別稱重。1.4.2 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)所有數(shù)據(jù)均采用SAS統(tǒng)計(jì)軟件中（ANOVA）進(jìn)行方差分析，多重比較用鄧肯氏法(DUNCAN)。1.5技術(shù)路線及可行性論證,,,,飼養(yǎng)試驗(yàn)：試驗(yàn)期7周，分兩個(gè)階段，0~3周齡和4~7周齡,第21、35、42、49日齡從每組各重復(fù)固定2只雞，空腹心臟采血。,第21、35、42、49日齡分別從每個(gè)重復(fù)選取兩只雞，取胸腺、法氏囊和脾臟。并稱

16、重與體重作比較。,,,測(cè)定谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）活性,用于測(cè)定堿性磷酸酶(AKP)、血清銅藍(lán)蛋白(CP) ，丙二醛（MDA），血清銅鋅超氧化物歧化酶（Cu,ZnSOD）的含量,,分別在第7、14日齡接種NDV疫苗。,,,,用酶聯(lián)免疫方法測(cè)定NDV抗體效價(jià)。,用α-乙酸萘酯酶染色法和體內(nèi)誘導(dǎo)法分別測(cè)定淋巴細(xì)胞百分?jǐn)?shù)和淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率。,分離 血清,加2%肝素鈉抗凝全血,2、研究工作的總體安排及進(jìn)度2005.7～2006.3

17、 搜集并整理資料，準(zhǔn)備試驗(yàn)的前期工作；2006.4～2007.1 操作飼養(yǎng)試驗(yàn)，并檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)；2007.2～2007.5 統(tǒng)計(jì)分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，總結(jié)試驗(yàn)結(jié)果并撰寫論文,四、研究基礎(chǔ)和已具備的工作條件1、與本項(xiàng)目有關(guān)的研究基礎(chǔ)，已發(fā)表的論文 本課題是在查閱了大量有關(guān)氨基酸螯合鋅、維生素E及其相互關(guān)系方面的中外文資料，借鑒前人研究經(jīng)驗(yàn)，熟練掌握相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)分析技術(shù)的基礎(chǔ)上提出的。,,2、已有的主要儀器設(shè)備，尚缺的儀器設(shè)備及解

18、決途徑 本試驗(yàn)可利用我校動(dòng)物科技學(xué)院實(shí)驗(yàn)室及牧站實(shí)驗(yàn)室，本研究所需的主要儀器設(shè)備有酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀、分光光度計(jì)等，購買雛雞和配料等問題可以解決。,五、本研究項(xiàng)目經(jīng)費(fèi)預(yù)算（單位：萬元）  1. 科研業(yè)務(wù)費(fèi)：0.1  2. 實(shí)驗(yàn)材料費(fèi)：①試驗(yàn)雞及養(yǎng)殖費(fèi)：0.4 ②藥品費(fèi)： 0.3

19、 共計(jì)： 0.8,,謝謝大家,,[1] α一醋酸萘酯染色法1、基本原理：T淋巴細(xì)胞的胞漿內(nèi)存在著酸性α一醋酸萘酯酶，在弱酸性條件下，能使底物醋酸萘酯水解，產(chǎn)生醋酸離子和α一萘酚。其中α一萘酚與六偶氮副品紅偶連，生成不溶性的紅色沉淀物，沉積在T淋巴細(xì)胞胞漿內(nèi)酯酶所在的部位。經(jīng)甲基綠復(fù)染后，反應(yīng)顆粒變暗而呈深紫紅色。2、所需試劑 4%

20、副品紅鹽酸溶液；4%亞硝酸鈉水溶液(現(xiàn)用現(xiàn)配)；2%α一乙酸萘酯乙二醇甲醚溶液(現(xiàn)用現(xiàn)配)；福爾馬林一丙酮固定液；PH7.6磷酸鹽緩沖液(PBS)；0.5%孔雀綠染色液；孵育液配制(現(xiàn)用現(xiàn)配)。3、操作步驟靜脈取血，載玻片上涂血片2張，晾干，將血片置冷的福爾馬林一丙酮固定液中，4℃下固定lmin。取出血片用自來水沖洗3min，用蒸餾水沖掉自來水，室溫干燥；將血片放入孵育液中，37℃孵育1.5hr，取出血片，水洗3min，用雙餾水沖去

21、沉淀物，孔雀綠染色液復(fù)染lmin，自來水和雙餾水先后沖洗，晾干，油鏡觀察，計(jì)數(shù)100個(gè)淋巴細(xì)胞，求出ANAE陽性細(xì)胞百分比。,,[2]淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn) 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化是體外檢測(cè)T淋巴細(xì)胞功能的一種方法。取肝素抗凝血0.lml，無菌加入1.8ml的RPM11640完全培養(yǎng)液(含20%小牛血清，青霉素、鏈霉素各100ug/m1，30.0g/lL-谷氨酸lml，PH7.6)，再加入0.lmlPHA，置37℃3天，每天搖動(dòng)一次。

22、取出后吸出大部分上清夜，加入8.5g/lNH4Cl4ml，混勻后置37℃水浴10分鐘。2500離心l0分鐘，棄上清，沉淀后加5ml固定液(甲醇：冰醋酸=9:1)，室溫中l(wèi)0分鐘后離心棄上清，留0.2ml沉淀。輕輕混勻后滴加于一潔凈玻片上，使其均勻鋪開。自然干燥后用Giemsa染液染色，油鏡一下觀察200個(gè)淋巴細(xì)胞，計(jì)算其母細(xì)胞轉(zhuǎn)化率。,[3]酶聯(lián)免疫吸附方法一、主要儀器 酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(Bio－550) 酶標(biāo)板 (9

23、6孔) 微量注射器。二、主要試劑 HRP標(biāo)記羊抗兔Ig G(1:1 000，國產(chǎn))；標(biāo)準(zhǔn)牛IgG；兔抗牛血清（1：32）；碳酸鹽一重碳酸鹽緩沖液(pH= 9.6)；檸檬酸鹽緩沖液(pH =4.0)； 磷酸鹽緩沖液PBS ；ELISA緩沖液：PBS + 1 % BSA ；清洗液：PBS+0 .05%Tween 20；底物溶液貯液為20 mg/ml ABTS，使用時(shí)用檸檬酸鹽緩沖液稀釋20倍，再用等體積的0.3%H2O稀

24、釋；終止液。三、操作步驟 1. 包被抗原和洗滌 2. 加封閉液200微升，37℃放置一小時(shí)。洗滌(同2 ). 3 . 加被檢血清：用稀釋液將被檢血清作幾種稀釋, 每孔200微升。同時(shí)作稀釋液對(duì)照。 37℃放置2小時(shí)。洗滌(同2 ). 4. 加辣根過氧化物酶羊抗兔IgG, 每孔200微升, 放置37℃ 1小時(shí)，洗滌(同2 ) 。 5. 加底物：鄰苯二胺溶液加200ml，室溫暗處10--15分鐘。 6. 加終止液：每