1、1乳酸菌菌種的分離篩選方法乳酸菌菌種的分離篩選方法乳酸細(xì)菌是一類能利用發(fā)酵糖產(chǎn)生大量乳酸的細(xì)菌通稱。為兼性厭氧菌為兼性厭氧菌，桿，桿狀或球狀，狀或球狀，革蘭氏陽性菌，無芽孢，不運(yùn)動。營養(yǎng)要求高，需要提供豐富的肽類氨基酸維生素。在瓊脂表面或內(nèi)層形成較小的白色或淡黃色的菌落。通常用作為有益微生物的菌種有乳酸乳桿菌、干酪乳桿菌、植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、糞腸球菌、乳酸片球菌、雙歧桿菌、屎腸球菌、戊糖片球菌等。乳桿菌常用MRS瓊脂作半選擇培養(yǎng)基。

2、當(dāng)乳桿菌僅是復(fù)雜區(qū)系中的部分菌類時，SL培養(yǎng)基常用作為選擇性培養(yǎng)基。對于芽孢乳桿菌常用GYP培養(yǎng)基，鏈球菌有TYC培養(yǎng)基、MS培養(yǎng)基。M17培養(yǎng)基被用作乳球菌的分離培養(yǎng)基。嗜酸乳桿菌屬于乳桿菌屬的一個種。其特性為：桿菌，兩端圓，不運(yùn)動，無鞭毛。糞腸球菌為革蘭氏陽性，圓形或橢圓形。乳酸片球菌細(xì)胞呈球狀，直徑0.6~1.0μm，在直角兩個平面交替形成四聯(lián)狀，一般細(xì)胞成對生，單生者罕見，不成鏈狀排列。革蘭氏陽性，不運(yùn)動，兼性厭氧。在MRS培養(yǎng)

3、基上菌落小，呈白色。沿洋菜穿刺線的生長物呈絲狀。乳酸菌在一般瓊脂培養(yǎng)基上形成微小菌落，不易觀察，所以分離時先富集培養(yǎng)并選擇合適的培養(yǎng)基。分離培養(yǎng)基一般添加西紅柿、酵母膏、吐溫80等物質(zhì)，也常常加入醋酸鹽，因醋酸鹽能抑制部分細(xì)菌生長，對乳酸菌無害。培養(yǎng)基中添加碳酸鈣，乳酸溶解培養(yǎng)基中的碳酸鈣形成透明圈，作為分離鑒別的依據(jù)，通過對生成的乳酸量進(jìn)行性能鑒定。乳酸菌生長繁殖時需要多種氨基酸，維生素及微氧，一般菌落比較小。分離培養(yǎng)基一般可添加西紅

4、柿酵母膏油酸吐溫等物質(zhì)，均具有促進(jìn)生長作用。也常常添加醋酸鹽抑制有些細(xì)菌的生長，對乳酸菌無害。一.篩選方法：篩選方法：1.1.溶鈣圈法：溶鈣圈法：利用一些產(chǎn)酸類細(xì)菌在含利用一些產(chǎn)酸類細(xì)菌在含CaCO3CaCO3的培養(yǎng)基上產(chǎn)生的培養(yǎng)基上產(chǎn)生CaCO3CaCO3溶解圈，從而篩選出這溶解圈，從而篩選出這些產(chǎn)酸類細(xì)菌，可用于乳酸菌的篩選。些產(chǎn)酸類細(xì)菌，可用于乳酸菌的篩選。其中培養(yǎng)基中加入其中培養(yǎng)基中加入CaCO3CaCO3的作用是：①鑒別能產(chǎn)生

5、酸的細(xì)菌；②中和產(chǎn)生的的作用是：①鑒別能產(chǎn)生酸的細(xì)菌；②中和產(chǎn)生的酸，以維持培養(yǎng)基的酸，以維持培養(yǎng)基的PHPH。篩選過程：樣品預(yù)處理→梯度稀釋至篩選過程：樣品預(yù)處理→梯度稀釋至106106→選擇合適的稀釋度涂布→→選擇合適的稀釋度涂布→3737℃培養(yǎng)℃培養(yǎng)3乳糖乳糖5.0g5.0g蛋白胨蛋白胨5.0g5.0g酵母膏酵母膏3.0g3.0g0.50.5℅溴甲酚紫10ml自來水1000mlpH6.57.0pH6.57.0（分離用）（分離用）1

6、.91.9BCGBCG牛乳營養(yǎng)瓊脂牛乳營養(yǎng)瓊脂：脫脂奶粉：脫脂奶粉10g10g，溶于，溶于5050ml水中，加入1.6℅溴甲酚綠酒精溶液0.07ml，0.075Mpa20min。另取瓊脂2.0g，溶于，溶于5050ml水中，加酵母膏1.0g溶解后調(diào)pH6.56.8pH6.56.8，0.10.1Mpa20min.趁熱在無菌操作下兩者混合均勻，倒平板，37℃培養(yǎng)24h，檢查是否有雜菌。2.2.分離篩選分離篩選：2.12.1富集培養(yǎng)富集培養(yǎng)：

7、?。喝?.0g1.0g（1.01.0ml）于無菌細(xì)口瓶中，加入無菌）于無菌細(xì)口瓶中，加入無菌麥芽汁液體培養(yǎng)液于瓶口處，密閉，2532℃培養(yǎng)48h。若培養(yǎng)基表內(nèi)出現(xiàn)絹絲波紋物，鏡檢桿狀，革蘭氏陽性，初步定為乳酸菌。以同樣方法轉(zhuǎn)接23次，接種量35℅.2.2菌種分離純化：溶鈣圈法：溶鈣圈法：富集菌液或樣品適當(dāng)稀釋至107，混菌法分離，先加入1012mlMRSMRS培養(yǎng)基培養(yǎng)基或麥芽汁培養(yǎng)基，凝固后再注入45ml水瓊脂培養(yǎng)基，制成厭氧環(huán)境，3