1、結核病診斷新技術及其評價,寶雞市人民醫(yī)院呼吸科 魏勝全,內容,,二、生化檢測,三、細胞免疫學檢測,一、微生物學檢測,四、分子生物學檢測,呼吸醫(yī)生的尷尬？,先抗炎？？？再抗癆？？？實在不行，上化療？？？？,你懂的！TB 的診斷有時有多難！病原學檢測是診斷 TB 最重要的依據，但據 2013 年 WHO 統(tǒng)計，僅有 58% 的 TB 患者

2、有病原學依據。,前言,早期準確診斷是結核病 (TB) 患者得以及時治療的關鍵。目前的 TB 診斷水平仍然薄弱。據世界衛(wèi)生組織 (WHO) 估算， 2012 年的 860 萬新發(fā) TB 患者中，僅登記了 570 萬，還有 217.5 萬 (25.3%) 未被發(fā)現 (漏診)。提高診斷技術則是發(fā)現患者，減少誤診、漏診的核心。,2024/3/28,一 、微生物學檢測,包括涂片染色鏡檢、結核分枝桿菌 (MTB) 分離培養(yǎng)、 MTB 藥敏和

3、菌種鑒定等。染色涂片法是臨床上最便捷快速的診斷方法，但敏感度偏低，發(fā)達國家可檢出 50% 的活動性肺結核，我國檢出率一般約為 30%， 且無法區(qū)別非 MTB( Mycobacterium tuberculosis )。 MTB 分離培養(yǎng)是確診 TB 最重要的依據，不僅能取得病原學結果，還能進一步進行藥敏檢測，指導治療。目前常用的細菌培養(yǎng)基包括 Lowenstein-Jensen 固相培養(yǎng)基 (L-J 法) 和 M

4、iddlebrook 7H9 7H11 液體培養(yǎng)基。固相培養(yǎng)基價格低，但耗時長，需要 4~8 周取得結果，加上菌種鑒定的時間耗時更長?；?BACTEC MGIT 960、 BacT/Alert 3D 系統(tǒng)的液體培養(yǎng)基檢測速度有明顯提高 (1~4 周)， 但費用較高。,一 、微生物學檢測,1.1 MTB 快速培養(yǎng)法BACTEC MGIT 960 系統(tǒng)采用熒光增強原理，在培養(yǎng)管底部包埋對氧氣濃度高度敏感的指示劑，通過檢測氧氣濃度變化以監(jiān)

5、測培養(yǎng)管內 MTB 的生長狀態(tài)。陽性標本檢出時間相對較短，平均為 9 d， 后續(xù)菌種鑒定及藥敏試驗時間平均為 4 d。 BACTEC MGIT 960 系統(tǒng)為目前國際通行培養(yǎng)標準，培養(yǎng)陽性率較固體培養(yǎng)法高出 10% 左右，檢測界限 <10 個菌落形成單位 (CFU)/mL。 BacT/Alert 3D 系統(tǒng)采用比色法原理，通過監(jiān)測預處理標本中產生 CO2 與標本瓶中初始的 CO2 相比較，判斷是否存在 MTB 生長。同時可以進行藥

6、敏檢測。理論上培養(yǎng)速度較 L-J 法和 BACTEC MGIT 960 系統(tǒng)更快 (6~22 d)。1.2 直接顯微鏡檢技術 (MODS)工作原理依據于 MTB 在液體培養(yǎng)基中生長會出現特征性的索狀結構，該結構可以通過倒置顯微鏡觀察到。 檢測呼吸道標本中是否存在 MTB 的敏感度為 97.5%， 特異度為 94.4%， 出現陽性結果的中位時間約為 8 d 該方法無需昂貴的設備，簡單，相對快速。,二、生化檢測,TB 的生化檢測主要包

7、括腺苷脫氨酶 (ADA)、 乳酸脫氫酶 (LDH)、 血管緊張素轉化酶 (ACE) 等酶學檢測。此類方法簡單快速，適用于 TB 早期診斷及鑒別診斷，但由于缺少結核特異性的酶標而無確診價值。2.1 ADAADA 是嘌呤核苷代謝中重要的酶。胸 (腹) 腔積液 ADA 檢測對結核性胸 (腹) 膜炎鑒別診斷有重要意義，胸 (腹) 腔積液 ADA 濃度以 45U/L 為界，結核性大多超過此值，特異度及敏感度超過 80%。 胸 (腹) 腔積液

8、 ADA 與血清 ADA 比值 ≥1 更傾向結核性積液。而對于癌性及非特異性積液，其比值一般 8U/L，而后兩者一般正常， ADA 濃度 ≤8U/L。 結核性腦膜炎 表明，將 ADA 濃度 >8U/L 作為結核性腦膜炎診斷的閾值時，其診斷的總敏感度 96%。,二、生化檢測,2.2 LDH是一種糖酵解酶，幾乎存在于機體所有組織細胞的胞質內。對 TB 的診斷來說， LDH 可用于區(qū)別滲出性積液與漏出性積液，胸 (腹) 腔積液 LDH

9、 與血清 LDH 比值 ≥0.6， LDH 濃度 >200U/L 傾向滲出液。結核性胸 (腹) 腔積液的 LDH 濃度一般 >200U/L， 與癌性胸 (腹) 腔積液 LDH 濃度變化無特征性差異。2.3 ACE為二肽羧肽水解酶，又名激肽酶 I， 存在于肺、腎、腦、小腸、胎盤等組織的血管內皮細胞或上皮細胞及血漿。對 TB 的診斷來說，血清 ACE 的檢測主要用于 TB 與結節(jié)病的鑒別，后者血清 ACE 濃度升高多見。

10、結核性胸腔積液 ACE 濃度一般不升高，胸腔積液 ACE 與血清 ACE 比值 ≥1 更傾向結核性積液，而惡性積液的比值多 <1。,三、細胞免疫學檢測,MTB 為胞內致病菌，因此普遍認為 TB 的發(fā)病過程中細胞免疫占主導地位。細胞免疫學診斷主要包括結核菌素皮膚試驗 (tuberculin skin test， TST) 和 γ- 干擾素釋放試驗 (interferon gamma releaseassay， IGRA)， 而結合上

11、述兩種方法優(yōu)點的改良結核菌素皮膚試驗近年來發(fā)展很快。3.1 TST即 PPD 皮試或皮內 Mantoux 試驗。 TST 從 1890 年發(fā)明以來沿用至今。由于 TST 存在假陽性結果和假陽性結果，影響了其使用價值。假陽性結果大部分是由于結核菌素抗原與其他分枝桿菌有交叉抗原所致。這種交叉抗原反應來自潛在的非 MTB 感染或接種卡介苗引起的反應。假陰性結果有很多潛在的原因，遲發(fā)超敏反應低下常見于免疫受損者，包括人免疫缺陷病毒 (HI

12、V) 感染，長期使用激素等情況。陰性結果不能排除 MTB 感染。由于不同地區(qū)的感染背景差異較大以及沒有潛伏性結核感染 (LTBI) 的檢測金標準，導致 TST 的敏感度和特異度不能準確評價。,三、細胞免疫學檢測,3.2 血清學檢測WHO 和不少國家推薦使用 IGRA( interferon gamma release assay) 進行 MTB 感染的血清學檢測，這類試驗采用酶聯免疫吸附試驗 (ELISA) 和 (或)

13、酶聯免疫斑點法 (ELISPOT) 定量檢測全血和 (或) 外周血單核細胞在 MTB 特異性抗原刺激下釋放 γ- 干擾素的水平，用于診斷 LTBI 及輔助診斷 TB。 目前利用 IGRA 原理，有 2 種較為成熟的試劑盒，即 QuantiFERONTB GOLD In Tube 試劑盒 (QFT-GIT， Cellestis Incorporated， Carnegie， Australia) 和 T-SPOT. TB 試劑盒 (O

14、xford Immunotec， Abingdon，UK)， 先后被美國食品藥品監(jiān)督管理局 (FDA) 批準應用于臨床。檢測結果陽性可被判斷為 MTB 感染。 IGRA 在 24h之內就可以獲得結果，花費的時間比 TST 短，并且不會因為復強效應 (Booster 效應) 受到影響，可反復進行，在有試驗條件的醫(yī)院里，該試驗的操作和管理比 TST 更便捷，不需要專門的醫(yī)生多次觀察結果。同 TST 一樣，這種方法無法區(qū)分 LTBI 與活動性

15、肺結核，因此，不能單獨作為 TB 的確診依據。,三、細胞免疫學檢測,,Nil (不與抗原共孵育的血漿中γ干擾素的濃度 [ 陰性對照組])；TB antigen minus nil (與 3 種結核特異性抗原共孵育后血漿中Y- 干擾素的濃度減去陰性組的值)；mitogen minus nil ( 與有絲分裂原抗原共孵育后血漿中 Y- 干擾素的濃度減去陰性組的值；有絲分裂原管包含植物血凝素，能非特異性激活 T 細胞，作為陽性對照用以保證

16、細胞對抗原的反應能力和校正血樣的處理和孵。B 對于這種 IGRA，1 mL 血抽入到 3 根管中（陰性對照，陽性對照和 TB 抗原管）。計算 TB 抗原管中全血刺激產生的γ干擾素和陰性對照管中的γ干擾素的差值作為 TB 反應。陽性結果需滿足以下標準。(1) 陰性對照小于 8 IU/mL；(2) TB 抗原管減去陰性對照管結果≥0.35 IU/mL，且≥25% 陰性對照管結果；(3) 陽性對照管有反應。,細胞免疫學檢測,目前IGRA檢

17、測成本偏高，不適用于人群篩查。試驗結果在一定程度上受到T 細胞水平及活性的影響，對于免疫抑制或者免疫缺陷者可能會結果不準確。雖然有資料表明對于 HIV 感染、血液病、惡性腫瘤、矽肺以及慢性腎衰者，預防性治療 TB 潛伏感染的常用方法是 IGRA， 但對于其中嚴重的免疫抑制者， IGRA 的診斷價值會降低。對于中國人群來說， IGRA 并不能顯示出明顯超過 TST 的優(yōu)勢。MTB 核酸擴增檢測 (NAA) :是近年來 TB 診斷領域

18、中最有突破的，檢測手段日趨成熟。部分新型的核酸檢測技術 (如分子線性探針檢測) 得到了 WHO 的認可和推薦，可用于 TB 的診斷和耐藥檢測。理論上 NAA 敏感性很好，即使標本中只有極低拷貝數的細菌也能檢出，一般 24h 之內即可取得檢驗結果，并且在生物安全級別上要求相對較低，還可以通過檢測異煙肼和利福平的常見耐藥基因位點，從而篩查出耐藥 MTB。,三、分子生物學檢測,4.1 標準聚合酶鏈式反應 (PCR)是體外酶促合成特異 DNA

19、 片段的一種方法，由高溫變性、低溫退火 (復性) 及適溫延伸等幾步反應組成 1 個周期，循環(huán)進行，使目的 DNA 得以迅速擴增，具有特異性強、靈敏度高、操作簡便、省時等特點。它不僅可以通過核酸擴增檢測 MTB 的存在，同時可以對特定基因位點檢測來判斷菌株的耐藥性。理論上 PCR 對于存在細菌的標本都有較好的檢出率，但實際臨床上應用可能存在一定的偏差。假陽性結果主要由靶序列或擴增產物的交叉污染所致，假陰性結果的出現主要是影響 Ta

20、q 酶活性，包括以下 2 個方面：一是臨床標本中可能存在內源性抑制因子 (5%~20%)， 如 DNA 樣品中的蛋白質和重金屬離子；二是標本溶血、血紅蛋白殘留、處理過程中使用苯酚等物質。,三、細胞免疫學檢測,4.2 改進的核酸檢測技術傳統(tǒng) PCR 檢測總的敏感性尚不理想，同時可能存在污染、操作失當等因素的影響，因此隨后產生了多種改進手段，包括整合的 MTB 核酸擴增檢測試劑盒以及全自動化 MTB 檢測系統(tǒng)。前者包括如 GenP

21、robe MTB 核酸直接擴增檢測 (GenProbe amplified MTB direct test， AMTD； San Diego， CA， USA)、 羅氏 AmplicorMTB 檢測 (Roche amplicor MTB test， Basel， Switzerland)、 BD-ProbeTec SDAtest (Becton Dickinson， MD， USA)， 實時熒光核酸恒溫擴增檢測技術 (simultan

22、eous amplification and testing， SAT； 仁度生物，中國) 等商業(yè)試劑盒；后者主要指 GeneXpert MTB/RIF 系統(tǒng) (Cepheid， USA)。,分子生物學檢測,其中由于 WHO 的推薦， GeneXpert MTB/RIF 已在全球 60 多個國家使用，下文分別予以介紹。4.2.1 GenProbe MTB 核酸直接擴增檢測 恒溫擴增 16S rRNA， 以 MTB 復合群特異性探針檢

23、測擴增產物，采用轉錄介導的擴增技術對靶核酸進行擴增，采用化學發(fā)光物啞啶酯標記的 DNA 探針與擴增的靶基因進行雜交，探針與擴增產物交叉后利用雜交保護試驗去除未雜交的標記探針，最后利用化學發(fā)光儀檢測發(fā)光信號，可在 2h 內做出診斷。據報道，該方法的特異度 >95%， 對痰細菌培養(yǎng)陽性肺結核敏感度為 92%~100%， 對于痰細菌培養(yǎng)陰性肺結核敏感度為 40%~93%， 對于肺外結核敏感度約為 93%。4.2.2 羅氏 Ampl

24、icor MTB 檢測 擴增引物 16S rRNA 基因片段，然后于各種分枝桿菌菌種特異性的寡核苷酸探針進行反向斑點雜交或微孔板反向雜交鑒定菌群，部分研究表明，該方法總的特異度 >95%， 對于痰細菌培養(yǎng)陽性肺結核檢出 >97%， 對痰細菌培養(yǎng)陰性肺結核敏感度為 40%~73% ，對肺外結核敏感度為 77%~98%。,分子生物學檢測,4.2.3 BD-ProbeTec SDA test 半定量的鏈置換擴增技術，以 IS611

25、0 和 16S rRNA 為靶序列，經加熱變性后與特異性引物雜交，在 DNA 聚合酶的作用下產生帶限制性核酸內切酶識別位點的靶 DNA 序列，然后核酸內切酶在其識別位點將 DNA 雙鏈打開缺口， DNA 聚合酶繼之延伸缺口 3’端并替換下一條 DNA 鏈。被替換下來的 DNA 單鏈可以與引物結合并被 DNA 聚合酶延伸成雙鏈。該過程不斷反復，使靶序列高效擴增。該方法總的特異性 >90%， 對于痰細菌培養(yǎng)陽性肺結核檢出達 90%~1

26、00%， 對于痰細菌培養(yǎng)陰性肺結核敏感度 33%~100%， 對于肺外結核敏感度為76%。4.2.4 實時熒光核酸恒溫擴增檢測技術 在同一溫度下，首先通過 M-MLV 反轉錄酶產生靶標核酸的 1 個雙鏈 DNA 拷貝，然后利用 T7 RNA 多聚酶從該 DNA 拷貝上產生多個 (100~1000) RNA 拷貝；每個 RNA 拷貝再從反轉錄開始進入下一個擴增循環(huán)；同時，帶有熒光標記的探針和這些 RNA 拷貝特異結合，產生熒光。該熒

27、光信號可由熒光檢測儀器實時捕獲，直觀反映擴增循環(huán)情況。實時熒光核酸恒溫擴增檢測技術 試劑盒通過檢測 RNA 來證實 MTB 的存在，擴增效率極高， 15~30 min 即可將模板擴增 109 倍，理論上檢測靈敏度和準確性遠高于其他核酸檢測技術；該技術采用實時熒光閉管檢測，使污染得到有效控制；即使污染產生，由于擴增產物為 RNA， 環(huán)境中極易降解，從而大幅度提高檢測結果的可靠性。目前該試劑盒已獲批準于我國應用。,,PCR原理,分子生物

28、學檢測,4.2.5 GeneXpert MTB/RIF 系統(tǒng) GeneXpert MTB/RIF 檢測試劑盒為美國 Cepheid 公司開發(fā)的，適用于 GeneXpert 儀器，可在 2 h 內直接從患者新鮮痰液或凍存痰液中檢測是否還有 MTB 及對利福平的耐藥情況，整個過程都在一密閉環(huán)境中進行，該方法采用全自動實時熒光定量 PCR 原理，將樣品處理、核酸擴增、目標序列的實時檢測整合于一體，通過對 MTB特有的序列 rpoB 基因上于利

29、福平耐藥相關 81bp 的核心區(qū)域 (RRDR) 進行檢查。Boehme 等在 《新英格蘭醫(yī)學雜志》 發(fā)表報道，對 4 個 TB 高負擔國家的 1730 例疑似 TB 患者進行診斷評估，對于細菌培養(yǎng)陽性、涂片陽性的標本檢測時， MTB/RIF 的檢出率為 98.2% (551/561) ； 對于培養(yǎng)陽性、涂片陰性的標本檢測時， MTB/RIF 的一次檢出率為 72.5% (124/172)， 該檢測方法特異度達 99.2% (604

30、/694)。 與藥敏實驗相比， MTB/RIF 檢測方法對利福平耐藥患者的檢出率高達 97.6% (200/205)， 對利福平敏感患者的檢出率達 98.1% (504/514)。 Boehme 等對南非、秘魯、印度、阿塞拜疆、菲律賓和烏干達的 6648 例可能攜帶 MTB、 耐多藥 MTB 的疑似患者進行檢測， MTB/RIF 也取得類似結果。,GeneXpert MTB/RIF 系統(tǒng),分子生物學檢測,GeneXpert MTB

31、/RIF 系統(tǒng)評價 極大的改進了我們對 TB分子生物學診斷的看法，該系統(tǒng)高度全自動化，生物安全性好，速度快，對于 TB 的診斷是一大貢獻。但是該系統(tǒng)仍有未克服的缺陷：對于肺外結核、痰細菌培養(yǎng)陰性結核的檢出率不高，尤其是對于菌量極少的標本；對于中國人群來說，利福平耐藥是否真能預測大部分異煙肼耐藥尚不能確定；此外，檢測費用高也是限制其推廣的重要原因。,結語,TB 診斷技術近年來取得了很大進展，將為提高 TB 的診斷水平發(fā)揮重要