1、生物傳感器,中國科學(xué)院研究生院姚 鑫,E-mail: yaox@mail.tsinghua.edu.cn,學(xué)習(xí)這門課的目的 通過本課程的學(xué)習(xí)，了解各類生物傳感器的基本原理、特點、技術(shù)方法和應(yīng)用。了解生物傳感器的及發(fā)展趨勢，為以后從事相關(guān)領(lǐng)域研究打好基礎(chǔ). 參考書 張先恩主編，《生物傳感器》，化學(xué)工業(yè)出版社，北京，2006 布萊恩 R. 埃金斯 著，羅瑞賢等譯，《化學(xué)傳感器與生物傳感器》，化學(xué)工業(yè)出版社，

2、北京，2005,幾個生物傳感器的例子,DNA-表面等離子激元共振儀(SPR),多肽-電化學(xué),DNA-電化學(xué),PNA/DNA-SPR,,葡糖淀粉酶,支鏈淀粉,酶-石英晶體微天平,Figure 2. (A) Time courses of frequency changes of the amylopectinimmobilized QCM, responding to the addition of glucoamylase at (a)

3、 16, (b) 27, (c) 38, and (d) 54 nM. The curve (e) shows the hydrolysis of the pullulan-immobilized QCM at 540 nM glucoamylase (25 °C, 20 mM acetate buffer, pH 4.8, 0.1 M NaCl).,傳感器傳感器:是一種裝置,是檢測或測量一種物理性質(zhì)并進(jìn)行記錄,顯示或以其

4、他方式作出響應(yīng).,第一章 緒 論,分析生物技術(shù)的一個重要領(lǐng)域便是生物傳感器(biosensor),它是一個典型的多學(xué)科交叉產(chǎn)物,結(jié)合了生命科學(xué)、分析化學(xué)、物理學(xué)和信息科學(xué)及其相關(guān)技術(shù)，能夠?qū)λ枰獧z測的物質(zhì)進(jìn)行快速分析和追蹤。 生物的基本特征之一，是能夠?qū)ν饨绲母鞣N刺激作出反應(yīng)。其所以能夠如此，首先是由于生物能感受外界的各類刺激信號，并將這些信號轉(zhuǎn)換成體內(nèi)信息處理系統(tǒng)所能接收并處理的信號。例如，人能通過眼、耳、鼻

5、、舌、身等感覺器官將外界的光、聲、溫度及其它各種化學(xué)和物理信號轉(zhuǎn)換成人體內(nèi)神經(jīng)系統(tǒng)等信息處理系統(tǒng)能夠接收和處理的信號。 生物傳感器的出現(xiàn)，是科學(xué)家的興趣和科學(xué)技術(shù)發(fā)展及社會發(fā)展需求多方面雙驅(qū)動的結(jié)果，經(jīng)過30多年的發(fā)展，已經(jīng)成為一個涉及內(nèi)容廣泛、多學(xué)科介入和交叉、充滿創(chuàng)新活力的領(lǐng)域。,1.1 生物傳感器的發(fā)展歷程,20世紀(jì)60年代酶法分析：專一性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡便，但是測定周期長。離子選擇電極( ion sele

6、ctive electrode, ISE)：操作簡單，無需對樣品進(jìn)行欲處理——無試劑分析(non-reagental analysis)，但是只能檢測無機(jī)離子．1956 Leland C. Clark Jnr 隔離式氧電極1962 Leland C. Clark Jnr 酶傳感器( enzyme transducer)1967 S. J. Updike 葡萄糖酶電極1975 Yellow Springs Instrume

7、nt(YSI) 葡萄糖測定儀1975 C. Divis 用完整活細(xì)胞取代純酶制作傳感器1977 GA. Rechnitz 用糞便鏈球菌完整活細(xì)胞與氨敏電極組合成測精氨酸的微生物電極1977 Iso Karube和J. Janata 測BOD的微生物傳感器和測抗原的免疫傳感器,隨后出現(xiàn)了細(xì)胞器傳感器、細(xì)胞傳感器和組織切片傳感器20世紀(jì)70年代中期到80年代，生物技術(shù)、生物電子和微電子學(xué)不斷地滲透、融合，致使生物傳感器不再局限

8、于生物反應(yīng)的電化學(xué)過程，而是根據(jù)生物學(xué)反應(yīng)中產(chǎn)生的各種信息(如光效應(yīng)、熱效應(yīng)、場效應(yīng)和質(zhì)量變化等)了設(shè)計各種精密的探測裝置。1974 K. Mosbach 熱生物傳感器1974 Janata 酶場效應(yīng)晶體管1980 D. W. Lubbers 和N. Optiz　酶光纖傳感器1983 Giulbault 壓電晶體酶傳感器1976 A. H. Clemens等報道了以葡萄糖酶電極為基礎(chǔ)的第一個人工腎臟，隨后被Miles

9、公司開發(fā)成生命穩(wěn)定系統(tǒng)Biostator，用于重癥糖尿病人床邊監(jiān)護(hù)。1983 B.Liedberg利用表面等離子激元共振(Surface Plasmon Resonance)方法，能夠適時的對生物親和反應(yīng)進(jìn)行檢測，在次基礎(chǔ)上，瑞典Pharmacia公司在1990年推出商用儀器BIAcore，成為目前研究生物分子之間互相作用最優(yōu)秀的實驗工具。1984 A.E.G. Cass 首次建立了介體酶電極方法,利用化學(xué)介體戊二醛取代分子氧作為

10、氧化還原酶酶促反應(yīng)的電子受體,促成了1987年美國MediSene 公司開發(fā)成功印刷酶電極.,發(fā)展迅速 ※文章方面: web of science 中輸入“biosensor”共檢索到10035篇文章，約從1993-2006年。 ※功能方面：活體( in vivo)測定、多指標(biāo)測定和聯(lián)機(jī)在線(on line)測定。 ※檢測對象：各種常見的生物化學(xué)物質(zhì)，在臨床、發(fā)酵、食品、化工和環(huán)保等方面均顯示

11、了廣泛的應(yīng)用前景。,1984 華盛頓召開的國際生物工程年會上將生物傳感器列為當(dāng)代生物工程的重要領(lǐng)域之一1985 Elsevier科學(xué)出版公司創(chuàng)刊《生物傳感器》國際學(xué)術(shù)期刊，1990 更名為《生物傳感器和生物電子學(xué)》(Biosensors & Bioelectronics).1987 德國Dusseldor 召開以生物傳感為4個主題之一的BIOTECH’87.,表 1-1 歷屆世界生物傳感器學(xué)術(shù)大會的主題內(nèi)容及其論文數(shù)量,生物

12、傳感器發(fā)展階段,,20世紀(jì)60～70年代，起步階段：傳統(tǒng)酶電極,20世紀(jì)70年代末期到80年代，發(fā)展高潮階段：介體酶電極,20世紀(jì)90年代以后,,市場開發(fā)獲得顯著成績,生物親和傳感器的技術(shù)突破（SPR）,酶的直接電化學(xué),1.2 生物傳感器的原理和特點,圖 1-2 生物傳感器傳感原理,生物敏感膜(biosensitive membrane)又稱分子識別元件(molecular recognition element),是生物傳感器的關(guān)鍵元

13、件，直接決定傳感器的功能和質(zhì)量．,表1-2 生物傳感器的分子識別元件,這里所說的膜是采用固定化技術(shù)制作的人工膜而不是天然的生物膜(細(xì)胞膜),表 1-3 生物學(xué)反應(yīng)信息和換能器的選擇,換能器的作用是將各種生物的、化學(xué)的和物理的信息轉(zhuǎn)化成電信號,生物傳感器的主要特點1、多樣性。根據(jù)生物反應(yīng)的特異性和多樣性，理論上可以制成測 定所有生物物質(zhì)的酶傳感器。2、無試劑分析。除了緩沖液以外，大多數(shù)酶傳感器不需要添加其它分析試劑。

14、3、操作簡單，快速、準(zhǔn)確，易于聯(lián)機(jī)。4、可以重復(fù)使用、連續(xù)使用，也可以一次性使用。,1.3 生物傳感器的基本概念與類型,基本概念 § 生物傳感器概念來源于Clark關(guān)于酶電極的描述，關(guān)鍵是傳感器的構(gòu)成中分子識別元件為具有生物學(xué)活性的材料。 § 首屆世界生物傳感器學(xué)術(shù)大會(Biosensor’s 90)上將生物傳感器定義為由生物活性材料與相應(yīng)的換能器的結(jié)合體，能測定特定的化學(xué)物質(zhì)(主要是生物物質(zhì))；而

15、將能用于生物參量測定但構(gòu)成中不含生物活性材料的裝置稱為生物敏(biosensing)傳感器。§ Turner教授定義為：生物傳感器是一種精致的分析器件，它結(jié)合一種生物的或生物衍生的敏感元件與一只理化換能器，能夠產(chǎn)生間斷或連續(xù)的數(shù)字電信號，信號強(qiáng)度與被分析物成比例。,圖 1-3 生物傳感器分類,類型,圖 1-3 生物傳感器分類,類型,根據(jù)生物傳感器的特性還有其他的命名或分類,對于個別生物傳感器的命名,一般采用“功能

16、+構(gòu)成特征”的方法，比如：葡萄糖氧化酶電極，谷氨酸脫氫酶電極，BOD微生物電極，葡萄糖酶光纖傳感器等。,1.4 生物芯片,生物芯片,biochip,,,,芯片實驗室,分析生物芯片,,lab on chip,analytical biochip,圖 1- 4 生物芯片基本類型,生物計算機(jī)芯片的出現(xiàn)源于對傳統(tǒng)的硅芯片計算機(jī)的發(fā)展前景的憂慮。生物計算機(jī)20世紀(jì)80年代中期開始研制，最大的特點是采用了生物芯片。生物芯片由基因技術(shù)產(chǎn)生的

17、‘智能’蛋白質(zhì)分子構(gòu)成；在這種芯片中信息以波的形式傳播；其運(yùn)算速度比當(dāng)時最好的計算機(jī)快10萬倍； 能量消耗僅相當(dāng)于普通計算機(jī)的1/10；擁有巨大的儲存能力；能自動修復(fù)芯片發(fā)生的故障。,分析生物芯片伴隨人類基因組計劃的誕生和發(fā)展。解碼含大約30億個核苷酸的人類基因組，需要強(qiáng)大的DNA序列分析能力。DNA序列分析方法迄今都基于英國劍橋大學(xué)Sanger教授的酶法。1989 E. Southern 專利：分析多聚核苷酸序列。描述

18、了如何在固相載體（如玻片）上通過DNA雜交來對樣品DNA序列進(jìn)行測定，稱為雜交測序( sequencing by hybridization, SBH)。此方法可以用于點突變分析、基因組指紋、連接分析、mRNA表征、 mRNA類群分析和核酸序列分析。1988 Andrei D. Mirzabekov 論文：利用寡核苷酸對DNA測序的新方法；1991 改良雜交測序芯片。這些早期的報道開創(chuàng)了基因芯片研究領(lǐng)域。,圖 1-5 DNA芯片的應(yīng)用

19、領(lǐng)域( 從SCI-Expanded 和CCR-Expanded數(shù)據(jù)庫統(tǒng)計，截止2004年4月共294篇),芯片實驗室是另一類生物芯片，有時被稱為主動式生物芯片?？茖W(xué)家們試圖將生物化學(xué)分析的整個過程縮微到芯片上，通過微細(xì)加工工藝制作的微濾器、微分離器、微反應(yīng)器、微泵、微閥門、微電極等，實現(xiàn)對生物樣品從制備、分離、生化反應(yīng)到檢測和分析的全過程，從而極大地縮短檢測時間和分析時間，并節(jié)省實驗材料。 生

20、物芯片是一類在微小基片上，利用微加工技術(shù)、生物技術(shù)或化學(xué)合成技術(shù)制作的具有一定分析、檢測、儲存或計算功能的微型生物器件。,,1.5 生物傳感器的商品開發(fā),1.5.1 市場值2001-2003 全球生物傳感器銷售額50億美元2003 全球生物傳感器銷售額73億美元(應(yīng)用領(lǐng)域包括醫(yī)學(xué)、生物防范、食品與飲品、環(huán)境、生物/藥物研究)2007 全球生物傳感器的市場總值將達(dá)108億美元商品化的生物傳感器主要有5種類型：

21、酶電極生化分析儀 BOD測定儀 手持式血糖測定儀 SPR分析儀 各類生物芯片,1.5.2 酶電極生化分析儀 1972-1975年美國 Yellow Springs 儀器公司在Clark酶電極的基礎(chǔ)上研制出第一個商品葡萄糖分析儀(YSI Glucose Analyer Model-23)。 YS2300乳酸分析儀 YS2700 SELECTTM 系列生化分析儀

22、 YS2710 自動分析24份樣品 YS2710 在線分析(on line analysis)1.5.3手持式血糖測定儀 1987年英國MediSense公司開發(fā)出第一個手掌型和筆型血糖測定儀Exac TechTM 我國有30種手持式血糖測定儀,年銷售額已近10億美元.1.5.4 SPR分析儀 1990年瑞典Pharmacia公司基于 SPR生物傳感器原理的生物分子相互作用開發(fā)

23、BIACore分析儀.,1.6 發(fā)展趨勢 1) 電化學(xué)生物傳感器和光生物傳感器(熒光,生物發(fā)光和化學(xué)發(fā)光),兩類傳感器占主流. 2)上升趨勢型:生物芯片,分子印跡/模擬傳感器,表面等離子體(SPR)生物傳感器 穩(wěn)定發(fā)展型:光生物傳感器和壓電生物傳感器. 下降趨勢型: 熱生物傳感器報道很少,電化學(xué)生物傳感器的比例下降 3)2003~2004年發(fā)表論文數(shù)量順序:電化學(xué)生物傳感器&

24、gt;光生物傳感器>生物芯片>壓電生物傳感器>半導(dǎo)體生物傳感器>表面等離子體生物傳感器>熱生物傳感器 另外,分子生物學(xué)和基因工程方法在生物傳感器研究中逐步獲得應(yīng)用生物傳感器的發(fā)展趨勢: 1) 更加靈敏、準(zhǔn)確、快速和簡便是分析科學(xué)技術(shù)發(fā)展趨勢的共同特征。 2) 生物芯片使高通量、多參數(shù)的同步測定成為可能 3) 挑戰(zhàn)性需求包括體內(nèi)測定、細(xì)胞內(nèi)測定、單分子分析、

25、在線測定等。為了滿足這些要求，基因技術(shù)，納米技術(shù)，各種單分子熒光技術(shù)，仿生技術(shù)或生物模擬技術(shù)得到發(fā)展。,生物體本身就是各種精巧生物傳感器的匯集體,其結(jié)構(gòu)的精密程度和完善的功能都是迄今任何人工傳感器所不能比擬的.美國Oak Bridge 國家實驗室提出感知化學(xué)和生物試劑的生物報告(bioreporter)技術(shù). 其基本原理是將能夠產(chǎn)生光學(xué)信號或其他信號的報告基因與啟動子promoter順序克隆,當(dāng)細(xì)胞環(huán)境中有被分析物存在時,細(xì)胞啟

26、動子受激啟動報告基因的轉(zhuǎn)錄,然后利用細(xì)胞的整套翻譯機(jī)制譯成報告蛋白質(zhì),并產(chǎn)生可以檢測的信號.,圖1-7 完整細(xì)胞或生物體傳感過程模式圖解當(dāng)生物體與特異的分析物接觸時,啟動子/報告基因復(fù)合物被轉(zhuǎn)錄成信使RNA(mRNA), 然后翻譯成報告蛋白質(zhì),最終形成響應(yīng)信號,在生物傳感發(fā)展進(jìn)程中，我們只不過剛剛結(jié)束在黑暗中摸索，開始在陽光下耕作沃土??Clark,第二章 分子識別元件及其生物反應(yīng)基礎(chǔ),2.1 概述 生物傳

27、感器的分子識別元件又稱敏感元件，主要指來源于生物體的生物活性物質(zhì)，包括酶、抗原、抗體和各種功能蛋白質(zhì)、核酸、微生物細(xì)胞、細(xì)胞器、動植物組織等。當(dāng)它們用作生物傳感器的敏感元件時，都無一例外地具有對靶分子（待檢測對象）特異的識別功能。,本章主要內(nèi)容,酶反應(yīng)微生物反應(yīng)免疫學(xué)反應(yīng)核酸反應(yīng)催化抗體催化核酸生物反應(yīng)中伴隨著發(fā)生的物理量變化,2.2 酶及酶反應(yīng)2.2.1 酶反應(yīng)基本概念一) 酶的定義 酶(enz

28、yme)是細(xì)胞產(chǎn)生的、以蛋白質(zhì)為主要成分、能加快反應(yīng)速率、并且具有催化專一性的生物催化劑。 酶是活細(xì)胞產(chǎn)生的一類具有特殊三維空間構(gòu)象的功能化蛋白質(zhì)。生物體內(nèi)代謝過程中發(fā)生的化學(xué)反應(yīng)絕大多數(shù)是在酶的催化下進(jìn)行的，酶的存在是在生物體進(jìn)行新陳代謝的必要條件。 酶具有催化劑的共性： 可以降低生化反應(yīng)的活化能，使活化分子數(shù)大大增加，故少量的酶即可大大加快反應(yīng)的速度。 只改變反應(yīng)速度而

29、不改變反應(yīng)的平衡點，即酶加速達(dá)到平衡而不改變平衡的位置，它不能催化熱力學(xué)上不能進(jìn)行的反應(yīng)。 酶參加生化反應(yīng)前后無變化，故可重復(fù)使用，因而具有化學(xué)放大的功能。,二) 酶的蛋白質(zhì)性質(zhì),酶都是蛋白質(zhì)，或者以蛋白質(zhì)為主要成分。主要證據(jù)：蛋白質(zhì)是氨基酸組成的，而酶的水解產(chǎn)物都是氨基酸，酶也是由氨基酸組成的。酶具有蛋白質(zhì)所具有的顏色反應(yīng)。一切能使蛋白質(zhì)變性的因素，如熱、酸、堿、紫外線等，同樣可以使酶變性失活。酶同樣具有蛋白質(zhì)所

30、具有的大分子性質(zhì)，如不能透過半透膜，可以電泳，并有一定等電點。,三) 酶的催化性質(zhì) 酶是生物催化劑，與一般催化劑相比較有如下特點： 1) 高度專一性( specification)，或稱特異性?！耙环N酶，一種底物” 2) 催化效率高。以分子比為基礎(chǔ)，其催化效率是其他催化劑的107~1013倍。 3) 酶是蛋白質(zhì)，遇高溫、酸堿容易失活，酶催化一般在溫和條件下進(jìn)行。 4) 有些酶(如脫氫酶)需要輔酶或輔基，若輔助成分除去，

31、則酶不表現(xiàn)催化活性。 5) 酶在體內(nèi)的活力常常受多種方式調(diào)控，包括基因水平調(diào)控，反饋調(diào)節(jié)，激素控制，酶原激活等。 6) 酶促反應(yīng)產(chǎn)生的信息變化有多種形式，如熱、光、電、離子化學(xué)等。,四) 酶的分類與命名 1955年,國際酶學(xué)委員會(International Commission on Enzymes, EnzymeCommission, EC)成立,解決酶的命名問題. 1964年,EC定了酶分類的標(biāo)準(zhǔn),按

32、照酶的催化反應(yīng)類型,將酶分為六大類: 1) 氧化還原酶類(oxidoreductases) A?2H + B A+B ?2H 包括氧化酶,過氧化物酶,脫氫酶等 2) 轉(zhuǎn)移酶類(transferases):催化某一化學(xué)基團(tuán)從某一分子到另一分子 A? B + C A+B ?C

33、B為被轉(zhuǎn)移的基團(tuán),如磷酸基,氨基,酰胺基.包括轉(zhuǎn)氨酶,轉(zhuǎn)甲基酶等 3) 水解酶類(hydrolases):催化水解反應(yīng),在底物特定的鍵上引入水的羥基和氫 A? B + H2O AOH+BH 包括肽酶(即蛋白酶,水解肽鍵),酯酶(水解酯鍵),糖苷酶(水解糖苷鍵)等 4) 裂合酶類(lyases):催化C-C, C-O, C-N, 或C=S鍵裂解

34、或縮合 AB A+B 如脫羧酶,碳酸苷酶,5) 異構(gòu)酶類(isomerases)使底物分子內(nèi)發(fā)生重排 A A’ 6) 合成酶類(ligases)或稱連接酶類,它催化兩個分子的連接,并與腺苷三磷酸(ATP)的裂解偶聯(lián),同時產(chǎn)生腺苷單磷酸(AMP)和焦磷酸(PPi) A + B + ATP

35、 AB + AMP + Ppi 如氨基酸激活酶類 在每一大類中都有若干亞類,每個亞類可再分成若干亞亞類,每個亞亞類包括若干種具體的酶,每一種酶在國際系統(tǒng)分類中的位置用特定的四個數(shù)字組成的編號表示.酶學(xué)編號(EC number) 由4個數(shù)字構(gòu)成,如脂肪酶(甘油酯水解酶)的系列編號為“EC 3.1.1.3”,表示第三大酶類(水解酶),第一亞類(水解發(fā)生在酯鍵),第一亞亞類(羥基酯水解

36、),甘油酯水解酶.,五) 酶量表示法 酶活力單位用國際單位(International Unit, IU)表示.一個酶活力單位指在特定條件下(如25℃,pH及底物等其他條件采用最佳條件),在1min能轉(zhuǎn)化1?mol底物分子的酶量,單位為IU. 酶比活力(specific activity)指1mg酶所具有的酶活力,一般用IU/mg表示.比活性高,說明酶的純度高.

37、酶含量指每克或每毫升酶制劑含有的活力單位數(shù),即IU/g或IU/ml.2.2.2 酶的作用機(jī)理一) 降低反應(yīng)活化能 酶的構(gòu)象對底物分子顯示分子識別能力，可作為一種催化劑，加速反應(yīng)的進(jìn)程，這樣的反應(yīng)稱為酶促反應(yīng)。酶可以使反應(yīng)至少加速100萬倍。酶對應(yīng)的加速是通過酶與底物結(jié)合形成復(fù)合物以降低反應(yīng)的活化自由能實現(xiàn)的。這種復(fù)合物的形成為反應(yīng)提供了一條新的途徑，它的過度態(tài)能量要比沒有酶條件下相應(yīng)所需要的能量低的多。,圖2-1

38、 酶對反應(yīng)活化能的影響無酶摻入是活化能為G1,酶催化時降為G2,但反應(yīng)的自由能變化?G保持不變,B為反應(yīng)生成產(chǎn)物分子的能量狀態(tài),A 初態(tài)( initial)A*活化態(tài),過度態(tài) (transition state)G1活化能(energy of activation),活化能:在一定溫度下,1 mol底物全部進(jìn)入活化態(tài)所需要的自由能F (free energy),單位是 J/mol.,酶的高效催化活性來源于以下幾個

39、方面： 1)張變、扭曲效應(yīng)。進(jìn)行酶反應(yīng)時，底物先與酶形成酶-底物復(fù)合物，由于互補(bǔ)不甚精確，從而導(dǎo)致底物產(chǎn)生某種張變、扭曲，使基態(tài)底物轉(zhuǎn)變?yōu)檫^度態(tài)構(gòu)象，降低活化能，加快反應(yīng)速度。 2)酸堿催化。酶分子中具有各種酸性或堿性氨基酸側(cè)鏈，酸堿催化通過瞬時向反應(yīng)物提供質(zhì)子或從反應(yīng)物中汲取質(zhì)子，以穩(wěn)定過渡態(tài)，加速反應(yīng)。 3)親核、親電子催化。在催化時，親核催化劑或親電子催化劑能分別放出電子或汲取電子并作用底

40、物的缺電子中心或負(fù)電中心，迅速形成不穩(wěn)定的共價復(fù)合物，降低反應(yīng)自由能，加速反應(yīng)。 4)多元催化和協(xié)同效應(yīng)。酶分子是一個擁有多種不同側(cè)鏈基團(tuán)組成活性中心的大分子，這些基團(tuán)在催化過程中根據(jù)各自的特點發(fā)揮不同的作用。而酶的催化作用則是一個綜合結(jié)果，是通過這些側(cè)鏈基團(tuán)的協(xié)同作用共同完成的。,二)結(jié)構(gòu)專一性 酶催化的專一性是由酶蛋白分子(尤其是分子中的活性部分)結(jié)構(gòu)特性決定的,三)酶的輔助因子(co-factor)

41、 酶需要輔助因子才能行使催化功能.輔助因子包括金屬離子和有機(jī)化合物,它們構(gòu)成酶的輔酶(co-enzyme)或輔基(prosthetic group),與酶蛋白共同組成全酶(holoenzyme)。脫去輔基的酶蛋白不含有催化活性，稱為脫輔基酶蛋白(apoenzyme)，有時又稱為酶原(proenzyme, zymogen). 輔酶與酶蛋白松弛結(jié)合，可以通過透析法除去：輔酶A　　　　輔基與酶蛋白牢固結(jié)合

42、：金屬離子　　　　鐵卟啉(亞鐵血紅素，heme) 煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，NADH,四）酶的活性中心(active center) 酶的特殊催化能力只局限在它的大分子的一定區(qū)域,這個區(qū)域就是酶的活性中心,它往往位于分子表面的凹穴中。,活性中心的各基團(tuán)與附近的其他殘基有序的排列,使得這個部位的空間結(jié)構(gòu)恰好適合與底物分子直接緊密接觸,并具有適宜的非極性微環(huán)境,以利于基團(tuán)間發(fā)生靜電作用.

43、 一般認(rèn)為活性中心有兩個功能部分: 結(jié)合域(binding domain):參與同底物結(jié)合,決定酶促反應(yīng)的專一性 催化域(catalytic domain):直接進(jìn)行催化,決定酶的催化效率,五)“鄰近”效應(yīng)、“定向”效應(yīng) “鄰近”(Vicinity)效應(yīng)指兩個反應(yīng)分子的反應(yīng)基團(tuán)需要互相靠近才能反應(yīng)。 但是，僅僅“鄰近”還不夠，還需要兩個將要反應(yīng)的基團(tuán)分子軌道交叉，而交叉的方向性極強(qiáng)，

44、稱為“定向”(orientation)。這樣就使得兩個分子間的反應(yīng)變?yōu)榉肿觾?nèi)的反應(yīng)，提高了反應(yīng)速率。 生物體系中的許多反應(yīng)屬于雙分子反應(yīng)，在酶的作用下，原游離存在的反應(yīng)物分子被結(jié)合在活性中心，彼此靠得很近，并且分子軌道也按確定的方向發(fā)生一定的偏轉(zhuǎn)，使得反應(yīng)易于進(jìn)行。有人估計， “鄰近”效應(yīng)及“定向”效應(yīng)可能使反應(yīng)速度增長上億倍。,六）誘導(dǎo)契合假說 活性中心通常為一個口袋或裂縫，由周圍的氨基酸鏈幫助結(jié)合底物

45、，而其他的氨基酸直接參與催化反應(yīng)。 1894年，德國生物化學(xué)家E. Fishcher提出“鎖-鑰假說” (lock-and-key hypothesis)，即酶與其特異性底物在空間結(jié)構(gòu)上互為瑣-鑰關(guān)系。 1958年,D.Koshland提出誘導(dǎo)契合假說(induced fit hypothesis):,,,底物,酶,,酶-底物復(fù)合物,,,底物,酶,底物變形,酶分子變形,七）酶催化的化學(xué)

46、形式 酶催化的化學(xué)形式主要包括共價催化和酸堿催化。 在共價催化中，酶與底物形成反應(yīng)活性很高的共價中間物，這個中間物很易變成過渡態(tài)(transition state),故反應(yīng)的活化能大大降低，底物可以越過較低的能閾而形成產(chǎn)物。 酸堿催化廣義的指質(zhì)子供體及質(zhì)子受體的催化。酶反應(yīng)中的酸堿催化十分重要，發(fā)生在細(xì)胞內(nèi)的許多反應(yīng)都是受酸堿催化的。 酶蛋白中可以起酸堿催化作用的功能團(tuán)有氨基、羧基、巰基

47、、酚羥基及咪唑基等。,2.2.3 酶促反應(yīng)的米氏動力學(xué) 底物濃度對酶促反應(yīng)速度的影響比較復(fù)雜，將反應(yīng)初速度?對底物濃度[S]作圖：,1、底物濃度低時，反應(yīng)速度隨底物濃度的增加呈線性增長，表現(xiàn)為一級反應(yīng)。2、隨著底物濃度的增加，反應(yīng)速度增高趨緩，表現(xiàn)為混合反應(yīng)。3、再繼續(xù)加大底物濃度，反應(yīng)速度趨向一個極限，近似零級反應(yīng)，說明酶已被飽和，這是酶促反應(yīng)特有的現(xiàn)象。,Michaelis和Menten首先提出酶促反應(yīng)

48、中存在著酶-底物中間復(fù)合物，并將酶促反應(yīng)過程表示為： E + S ES E + P (2-7) 從這一理論出發(fā)，根據(jù)化學(xué)平衡原理，推導(dǎo)出表示底物與反應(yīng)濃度與反應(yīng)速度之間的關(guān)系方程式： 這就是米氏方程( Michaelis equation ).式中，Vm為最大反應(yīng)速度

49、， KM為米氏常數(shù)(Michaelis constant ).根據(jù)規(guī)定，米氏常數(shù)是(2-7)中三個解離常數(shù)的復(fù)合函數(shù)： KM=(k1+k2)/Kcat,? = Vm[S]/(KM+[S]),米氏常數(shù)在數(shù)值上等于酶促反應(yīng)速度達(dá)到最大速度一半(1/2VM)時的底物濃度，單位為mol/L或mg/L，是酶的重要特征常數(shù)，它可以通過將米氏方程變換成雙倒數(shù)方程實驗求得。 對于KM，還可以作如下分析：

50、 1)一定條件下，酶的KM是常數(shù)。對不同來源的酶，比較其KM，可確定哪些酶是同種酶，哪些酶是同工酶(催化作用相同，但性質(zhì)或構(gòu)造不同的酶)。 2)KM受pH與溫度等環(huán)境因素的影響，在不同環(huán)境條件下求出KM，可探索環(huán)境對KM乃至對酶活性的影響。 3)如果酶作用底物有幾種，則最小KM(也有用最小Vm/KM比值)表示底物與酶的最適底物或天然底物。 4)從酶的KM可粗略估計細(xì)胞內(nèi)底物濃度變動范圍，一

51、般來說，底物濃度不會比KM高出太多。 5)從KM與米氏方程式，可以求出達(dá)到規(guī)定反應(yīng)速度的適當(dāng)?shù)牡孜餄舛龋蛞阎孜餄舛认孪鄳?yīng)的反應(yīng)速度。理論上，若是達(dá)到最大反應(yīng)速度，底物濃度至少要20 KM。,圖2-5 酶動力學(xué)溫態(tài)期反應(yīng)物質(zhì)濃度變化,,,穩(wěn)態(tài)假說The Steady-State Assumption,催化常數(shù)Kcat(catalytic constant)是酶動力學(xué)的第二個重要常數(shù),用來直接描述酶分子活力:在最適合的

52、底物濃度下,每摩爾酶每分鐘將底物濃度轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物的底物的摩爾數(shù)(或有關(guān)基因的當(dāng)量數(shù)). Kcat越大,在酶分子表面的催化事件發(fā)生越快,即催化效率高. Kcat的單位是s-1,因此, Kcat的倒數(shù)可以被看作是時間(s),即一個酶分子轉(zhuǎn)換一個底物分子所需要的時間,故Kcat有時被稱為轉(zhuǎn)化數(shù)(turnover number).,影響酶促反應(yīng)的因素 影響酶促反應(yīng)的因素很多，除了酶和底物的性質(zhì)，還有酶的抑制劑、溫度、p

53、H值、酶的活性和底物濃度等。 1)抑制劑 永久性(不可逆):不可逆抑制劑的結(jié)合位點通常與底物的結(jié)合位點不同，它是通過分解酶與底物的復(fù)合物來抑制反應(yīng)物的生成，因此這種抑制不能通過加過量的底物來消除?？捎没瘜W(xué)方法除去抑制劑，使酶復(fù)活。 暫時性(可逆)：是抑制劑和酶很快達(dá)成平衡。由于酶和抑制劑的結(jié)合是可逆的，所以可逆抑制劑可以被大濃度的正常底物所取代。 2)溫度

54、 溫度主要影響酶的穩(wěn)定性。它導(dǎo)致酶的構(gòu)象變化而影響酶和底物的結(jié)合，而降低酶促反應(yīng)的最大反應(yīng)速度。通常在4℃下保存。 3)pH pH對酶促反應(yīng)的影響：使酶的空間結(jié)構(gòu)破壞，引起酶的失活；影響酶活性部位催化基團(tuán)的解離狀態(tài)，使底物不能分解為產(chǎn)物；影響酶活性部位結(jié)合基團(tuán)的解離狀態(tài)，使其不能與底物結(jié)合；影響底物的解離狀態(tài)，使底物不能和酶結(jié)合，或結(jié)合后不能生成產(chǎn)物。,2.3微生物反應(yīng)2.3.1微生物反應(yīng)的

55、特點 微生物反應(yīng)過程是利用微生物進(jìn)行生物化學(xué)反應(yīng)的過程,就是將微生物作為生物催化劑進(jìn)行的反應(yīng).酶在微生物反應(yīng)中起最基本的催化作用. 微生物反應(yīng)與酶促反應(yīng)的共同點: 1)同屬生化反應(yīng),都在溫和條件下進(jìn)行; 2)凡是酶可以催化的反應(yīng),微生物也可以催化; 3)催化速度接近,反應(yīng)動力學(xué)模式近似.,,? 微生物反應(yīng)的特殊性: 1)微生物細(xì)胞的

56、膜系統(tǒng)為酶反應(yīng)提供了天然的適宜環(huán)境,細(xì)胞可以在相當(dāng)長的時 間內(nèi)保持一定的催化活性; 2)在多底物反應(yīng)時,微生物顯然比單純酶更適宜作催化劑; 3)細(xì)胞本身能提供酶促反應(yīng)所需要的各種輔助因子和能量; 4)微生物細(xì)胞比酶的來源更方便、更便宜. ? 微生物作為傳感器分子識別元件時不利因素： 1)微生物反應(yīng)通常伴隨細(xì)胞的生長和調(diào)亡，不易建立分析標(biāo)準(zhǔn)； 2)細(xì)胞是多酶系統(tǒng)，許多代謝途徑并存，難以排除不必要的反應(yīng)；

57、 3)環(huán)境變化會引起微生物生理狀態(tài)的復(fù)雜化,不適當(dāng)?shù)牟僮鲿?dǎo)致代謝轉(zhuǎn)換現(xiàn)象, 出現(xiàn)不期望有的反應(yīng).,2.3.2微生物反應(yīng)類型1)同化與異化 (根據(jù)微生物代謝流向) 同化作用(assimilation)或組成代謝: 細(xì)胞將底物攝入并通過一系列生化反映轉(zhuǎn)變成自身的組成物質(zhì),并儲存能量. 異化作用(disassimilation)或分解代謝:細(xì)胞將自身的組成物質(zhì)分解以釋放能量或排出體外. 2

58、)自養(yǎng)與異養(yǎng) (根據(jù)微生物對營養(yǎng)的要求) 自養(yǎng)(autotrophic):自養(yǎng)微生物的CO2作為主要碳源,無機(jī)氮化物作為氮源,通過細(xì)菌的光合作用或化能合成作用獲得能量. 異樣(heterotrophic):異養(yǎng)微生物以有機(jī)物做碳源,無機(jī)物或有機(jī)物作氮源,通過氧化有機(jī)物獲得能量. 絕大多數(shù)微生物種類都屬于異養(yǎng)型.,3) 好氣性與厭氣性 (根據(jù)微生物反應(yīng)對氧的需求與否)

59、 好氧(aerobic)性微生物:在有空氣的環(huán)境中才易生長繁殖的微生物. 厭氧(anaerobic)性微生物:必須在無分子氧的環(huán)境中生長繁殖的微生物.4)細(xì)胞能量的產(chǎn)生與轉(zhuǎn)移 微生物反應(yīng)所產(chǎn)生的能量大部分轉(zhuǎn)移為高能化合物. 高能化合物是指含轉(zhuǎn)移勢高的基團(tuán)的化合物,其中以ATP最為重要,它不僅潛能高,而且是生物體能量轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵物質(zhì),直接參與各種代謝反應(yīng)的能量轉(zhuǎn)移. 有兩類反應(yīng)可以產(chǎn)生AT

60、P.,2.3.3分析微生物學(xué) 分析微生物學(xué)(analytical microbiology)是利用微生物完成定量分析任務(wù)的學(xué)科.有些情況下,微生物測定法比化學(xué)方法更專一和靈敏,效率亦更高. 細(xì)胞增殖和呼吸法最常用.,b,2.4 免疫學(xué)反應(yīng) 免疫指機(jī)體對病原生物感染的抵抗能力. 自然免疫是非特異性的,即能抵抗多種病原微生物的損害. 獲得性免疫是特異性的,在微生物等抗原物質(zhì)刺激后才形成(

61、免疫球蛋白等),并能與該抗原起特異性反應(yīng).2.4.1抗原1)抗原的定義:抗原(antigen)是能夠刺激動物機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)的物質(zhì),但從廣義的生物學(xué)觀點看,凡是具有引起免疫反應(yīng)性能的物質(zhì),都可稱為抗原. 抗原有兩種性能:刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng) 免疫原性(immunogenicity) 完全抗原(complete antigen,Ag)與相應(yīng)免疫反應(yīng)產(chǎn)物發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng) 反應(yīng)原性(re

62、actionogenicity),,,,,半抗原(hapten),,2)抗原的種類 按抗原物質(zhì)的來源,抗原分為三類: (1) 天然抗原 (2) 人工抗原 (3) 合成抗原3)抗原的理化性質(zhì)(1)物理性狀 分子質(zhì)量對免疫原性的影響: 分子質(zhì)量越大抗原性越強(qiáng),原因在于復(fù)雜的大分子物質(zhì)表面抗原決定族較多,化學(xué)性質(zhì)相對穩(wěn)定,在體內(nèi)存留時間長,降解和排除速率較慢,有利于持續(xù)刺激肌體免疫系

63、統(tǒng),產(chǎn)生免疫應(yīng)答. 抗原構(gòu)型對免疫原性的影響:環(huán)壯構(gòu)型>直線構(gòu)型 聚合態(tài)分子>單體分子(2)化學(xué)組成 絕大多數(shù)為蛋白質(zhì),可為純蛋白質(zhì),也可為結(jié)合蛋白質(zhì),4)抗原決定簇(antigen determinant) 抗原決定簇是抗原分子表面的特殊化學(xué)基團(tuán)，抗原的特異性取決于抗原決定簇的性質(zhì)、數(shù)目

64、和空間排列。２.4.2抗體　　抗體(antibody)是由抗原刺激機(jī)體產(chǎn)生的具有特異性免疫功能的球蛋白，又稱免疫球蛋白(immunoglobulin, Ig)。人類免疫球蛋白有五類，即IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。,圖２-６免疫球蛋白(Ig)結(jié)構(gòu)模式圖,重鏈(heavy chain,H鏈): 分子質(zhì)量較大,420-460個氨基酸組成輕鏈(light chain,L鏈): 分子質(zhì)量較小,213-216個氨基酸組成,2.

65、4.3抗原-抗體反應(yīng) 抗原抗體的相互作用是所有免疫化學(xué)技術(shù)的基礎(chǔ).它們之間的反應(yīng)是指抗原與抗體之間發(fā)生的特異性結(jié)合反應(yīng).這種反應(yīng)可發(fā)生于體內(nèi)(in vivo),也可發(fā)生在體外(in vitro).體內(nèi)反應(yīng)可介導(dǎo)吞噬、溶菌、殺菌、中和毒素等作用;體外反應(yīng)則根據(jù)抗原的物質(zhì)性狀、抗體的類型及反應(yīng)的特點而分為凝聚、沉淀、溶解反應(yīng)等不同的類型。 抗體與抗原的特異性結(jié)合點位于Fab L鏈及H鏈的高變區(qū)(抗體活性中心

66、),其構(gòu)型取決于抗原決定簇的空間位置,兩者可形成互補(bǔ)性構(gòu)型. 抗原、抗體結(jié)合時準(zhǔn)確對位的兩個條件： 結(jié)合部位的形成要互補(bǔ)于抗原的形狀 抗體活性中心帶有與抗原決定簇相反的電荷 抗體的特異性是相對的，表現(xiàn)在： 部分抗體不完全與抗原決定簇相對應(yīng) 即便是針對某一種半抗原的抗體，其化學(xué)結(jié)構(gòu)也可能不一樣 抗原抗體結(jié)合在一定pH或離子強(qiáng)度下也是可逆的。,

67、,,,基于抗原-抗體反應(yīng)的檢測技術(shù)主要應(yīng)于以下幾個方面：1)用已知抗原檢測未知抗體2)用已知抗體檢測未知抗原3)定性或定量檢測體內(nèi)各種大分子物質(zhì)4)用已知抗體檢測某些藥物、激素等各種半抗原物質(zhì)影響抗原-抗體結(jié)合反應(yīng)的因素1)抗原抗體的性質(zhì):抗原-抗體反應(yīng)的整體強(qiáng)度受3個因素控制:抗體對表位的內(nèi)在親和力,抗原抗體的結(jié)合價以及參與反應(yīng)成分的立體結(jié)構(gòu).2)電解質(zhì):抗原抗體發(fā)生特異性結(jié)合后,由親水性膠體變?yōu)槭杷阅z體,電極質(zhì)的存在

68、會使抗原-抗體復(fù)合物失去電荷而沉淀或凝集,出現(xiàn)可見反應(yīng).3)酸堿度:蛋白質(zhì)具有兩性電離的性質(zhì),抗原抗體的反應(yīng)必須在合適的pH環(huán)境中進(jìn)行.4)溫度:一般在37℃,高溫抗原抗體變性,低溫反應(yīng)太慢.,2.4.4免疫學(xué)分析 免疫分析是利用抗體與抗原的特異性結(jié)合作用來選擇性識別和測定可以作為抗體或抗原的待測物.抗原-抗體反應(yīng)的特異性和專一性決定了免疫反應(yīng)具有很高的選擇性. 1)沉淀法 可溶性抗體與其相應(yīng)的抗原在液相中相互接觸