1、浙江大學(xué)博士學(xué)位論文Bacillus sp.EL31410彈性蛋白酶發(fā)酵條件優(yōu)化及分離純化研究姓名：徐瑩申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：食品科學(xué)指導(dǎo)教師：何國慶20050101摘 要L e u d e k i n g - P i r e t 方程和L e u d e k i n g - P i r e t - L i k e 方程分別描述了細(xì)胞生長、產(chǎn)物合成以及底物消耗動力學(xué)規(guī)律，所采取的動力學(xué)模型均能很好地擬合了實驗數(shù)據(jù)。建立的動力學(xué)模型如下

2、：生0．180(1-dt 南9 7 7 虹 ?，d p ：一生+ 4 ．2 7 8 x ( 2 ) 斑d t一竺：0 ．0 3 0 堡一7 ．5 3 x ( 3 )出 田3 ) B a c i l l u ss p ．E L 3 1 4 1 0 發(fā)酵液經(jīng)分級鹽析、D E A ES e p h a d e x A 5 0 離子交換柱層析和S e p h a d e x G 1 0 0 凝膠過濾柱層析，得到了純化的彈性蛋白酶。S D S -

3、 P A G E 結(jié)果表明，該純化后的產(chǎn)物為清晰的一條帶，分子量為3 1 8 2 0D a 。純化后彈性蛋白酶酶學(xué)性質(zhì)研究表明：最適作用溫度為5 0 “ C ；在3 0 ．5 0 ℃下，酶穩(wěn)定性是好：最適作用p H 因緩沖體系不同而存在差別：在硼酸．硼砂緩沖液中最適反應(yīng)p H 為7 ．4 ，而在“ I r i s —H C I 緩沖液中最適反應(yīng)p H 為8 ．2 ，彈性蛋白酶在p H7 - 8 范圍內(nèi)穩(wěn)定性最好；有些離子在低濃度時，對彈

4、性蛋白酶有維持穩(wěn)定和激活作用，如鈣離子、鉀離子等；而其他離子均表現(xiàn)了不同程度的抑制作用；還比較了該彈性蛋白酶對不同蛋白水解情況，彈性蛋白酶對彈性蛋白( 可溶性) 水解能力最強，對血紅蛋白、可溶性絲素( 分子量大于1 0 0 0 0 ) 和牛白蛋白的水解能力依次降低。對精練絲素、干酪素和明膠也有一定程度地水解。4 ) 篩選出對彈性蛋白酶熱穩(wěn)定性有保護(hù)作用的物質(zhì)：P A 、P B 和氯化鈣。結(jié)合單因素實驗，采用正交實驗設(shè)計優(yōu)化出P A 、P

5、 B 和氯化鈣的最佳使用濃度。得到了復(fù)合保護(hù)劑配方，即P A 2 ％、P B1 ．5 ％和水合氯化鈣1m m o l F L 。復(fù)合保護(hù)劑的添加使得彈性蛋白酶熱穩(wěn)定性提高了1 0 ℃，使該酶在p H6 - 9 范圍都保持良好的穩(wěn)定性。運用加速貯藏試驗估算了含有保護(hù)劑彈性蛋白酶的貯存壽命，即在2 5 ℃、2 0 ℃、4 ℃和0 ℃時，活性損失5 0 ％需要的時間分別為：1 4 0 、3 3 0 、6 5 0 0 和1 6 0 0 0 天。