1、學位論文獨創(chuàng)性聲明1 毛‘8S 2 S學位論文獨創(chuàng)性聲明本人聲明所呈交的學位論文是本人在導師指導下進行的研究工作及取得的研究成果。據(jù)我所知，除了文中特別加以標注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得南昌大學或其他教育機構的學位或證書而使用過的材料。與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻均已在論文中作了明確的說明并表示謝意。學位論文作者簽名( 手寫) ：≯浮移 簽字同期：≯∥彥年／月廠3 日學位論文

2、版權使用授權書本學位論文作者完全了解 南昌大學 有關保留、使用學位論文的規(guī)定，有權保留并向國家有關部門或機構送交論文的復印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱。本人授權南昌大學可以將學位論文的全部或部分內容編入有關數(shù)據(jù)庫進行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復制手段保存、匯編學位論文。同時授權中國科學技術信息研究所將本學位論文收錄到《中國學位論文全文數(shù)據(jù)庫》，并通過網絡向社會公眾提供信息服務。( 保密的學位論文在解密后適用本授權書)學位論文作者

3、簽名( 手寫) ： 灑輔多t ／簽字同期：紗6 年 么月廠，日學位論文作者畢業(yè)后去向：工作單位：通訊地址：導師簽名c 手寫，一 簽字日期：例年∥月 ／婦、電話：郵編：摘要摘 要目的：利用分子克隆技術克隆人野生型全長A E 2 c D N A ，構建出p c D N A 3 ．1 ．w t ．A E 2 重組表達質粒，進行測序鑒定，并檢測該表達質粒對內皮細胞系H U V E C s A E 2 基因表達的影響，為進一步研究A E 2 在疾

4、病中的生物學功能提供物質基礎。方法：1 ．用D M E M + 1 0 ％F B S 培養(yǎng)基培養(yǎng)人H e L a 細胞，從H e L a 細胞中提取總R N A ；自行設計上下游各帶有N h e I 和H i n d I I I 限制性酶切位點的P C R 引物，采用R T - P C R 技術，將總R N A 反轉錄成c D N A ，再擴增出A E 2 基因全長c D N A 片段。2 ．用限制性核酸內切酶N h eI 和H i n

5、 d l l l 分別雙酶切p c D N A 3 ．1 質粒和A E 2c D N A 片段，電泳分離后回收純化兩端帶不同粘性末端的p c D N A 3 ．1 質粒和A E 2c D N A 片段；用T 4 D N A 連接酶連接p c D N A 3 ．1 質粒和A E 2 片段，將連接產物轉化入感受態(tài)細胞T O P I O ，在含有終濃度為5 0 m ∥m l A m p 的L B 固體培養(yǎng)基中篩選培養(yǎng)2 4 h 后，挑取單個陽

6、性菌落擴增，提取并純化重組體質粒p c D N A 3 ．1 - w t - A E 2 。3 ．用三種方案的限制性核酸內切酶酶切鑒定所構建重組載體p c D N A 3 ．1 ．w t ．A E 2 ，得出肯定結果后通過D N A 測序進一步鑒定。4 ．將綠色熒光蛋白質粒p E G F P ．N 2 轉染H U V E C s ，觀察2 4 h 、3 6 h 、4 8 h 及7 2 h 綠色熒光的表達量，確定轉染效率的時效關系而推測重

7、組質粒p c D N A 3 ．1 ．w t ．A E 2 的最佳轉染時間。5 ．將重組質粒p c D N A 3 ．1 一w t ．A E 2 轉染H U V E C s ，隨機分為三個組：正常對照( C o n t r 0 1 ) 組、轉染空質粒p c D N A 3 ．1 組、轉染重組質粒p c D N A 3 ．1 ．w t ．A E 2組。通過R T - P C R 和W e s t e r nB l o t t i n g

8、檢測H U V E C s 中A E 2 m R N A 和蛋白表達情況。結果：1 ．R T - P C R 擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳，在預期位置顯示了清晰的亮帶，這一結果提示已成功擴增出了特異性的目的基因A E 2 c D N A 。2 ．將分別雙酶切后的p c D N A 3 ．1 質粒和A E 2c D N A 片段用T 4 D N A 連接酶進行連接反應后，轉化感受態(tài)細胞T O P I O ，經A m p 篩選，在培養(yǎng)皿上可見陽