1、中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文人睪丸特異基因HSD-3.8功能的初步研究姓名：郭健申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：醫(yī)學(xué)指導(dǎo)教師：王琳芳;繆時英2001.5.1中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)畢業(yè)論文 摘要H S D 0 ．7 和H i s 。．t a g g e d P 6 2 。并根據(jù)所表達(dá)融合蛋白的谷胱甘肽一S一轉(zhuǎn)移酶( G S T ) 并N6 個H i s 標(biāo)記進(jìn)行親和純化。同時用S D S - - P A G E切膠純化的方法純化了p E T 3 0 a

2、 - - p 6 2 重組質(zhì)粒在大腸桿菌中的表達(dá)產(chǎn)物，免疫兔子后獲得了高效價的多克隆抗體，W e s t e mB l o t 檢測顯示其有較好的特異性。利用這些重組蛋白進(jìn)行體外結(jié)合試驗，結(jié)果未觀察到H S D 0 ．7和P 6 2 的結(jié)合。分析原因可能是因為我們采用包含體變性復(fù)性的方法純化P 6 2 蛋白，在復(fù)性的過程中可能使蛋白質(zhì)失去活性。另外由于H S D 0 ．7 能和G T P 結(jié)合，且具有G T P a s e 的活性，其功

3、能可能受G T P ／G D P 轉(zhuǎn)化的調(diào)節(jié)。因此體外純化的單一H S D 0 ．7 蛋白可能無法發(fā)揮其正常的作用。為在真核細(xì)胞內(nèi)驗證H S D 0 ．7 和P 6 2 的相互作用，我們構(gòu)建了p c D N A 5 ／v 6 B —H A —H S D 0 ．7 和p c D N A 5 ／v 6 B —f l a g - - p 6 2 真核表達(dá)載體，用與S e p h a r o s e 耦聯(lián)的葡萄球菌P r o t e i n A

4、 在C O S 一7 細(xì)胞內(nèi)免疫共沉淀H S D 0 ．7 和P 6 2 ，初步試驗未見P 6 2 的沉淀區(qū)帶。該實驗尚待重復(fù)。為確定H S D 0 ．7 與P 6 2 的作用是否必須有P ．L o o p 結(jié)構(gòu)域存在才能發(fā)生，我們設(shè)計了不同的引物，擴增H S D 0 ．7 序列中的三個不同的片段，分別不含P ．L o o p ，含有部分P ．L o o p ，以及含有全部的P ．L o o p ，構(gòu)建了此三片段與酵母表達(dá)載體的重組質(zhì)粒