1、授予單位代碼：學(xué)號(hào)或申請(qǐng)?zhí)枺好?級(jí)：鄭州大學(xué)碩士學(xué)位論文1 0 4 5 9公開(kāi)論文題 目： 表達(dá)B 7 ．2 ／h T E R T 載體的構(gòu)建和表達(dá)作 者 姓 名： 丁 麗學(xué) 科 門(mén) 類： 醫(yī) 學(xué)專 業(yè) 名 稱： 免疫學(xué)導(dǎo)師姓名、職稱： 藿國(guó)囂鍪鬟2 0 0 6 年5 月鄭州大學(xué)2 0 0 6 屆碩士畢業(yè)論文 中文摘要連接。分別將構(gòu)建的p G E M —T _ h T E R T 、p E G F P —C 3 一B 7 ．2 質(zhì)粒用K

2、 p nI ，X b aI 內(nèi)切酶消化，回收雙粘h T E R T 和p E G F P —C 3 一B 7 ．2 ，用T 。D N A 連接酶連接，構(gòu)建的p E G F P —C 3 一B 7 ．2 咱T E R T 真核表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)P C R 和測(cè)序鑒定后，轉(zhuǎn)染C H O ( 中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢) 細(xì)胞，用免疫熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)情況。結(jié)果：R T —P C R 擴(kuò)增目的基因B 7 ．2 和h T E R T ，瓊脂糖凝膠電泳證實(shí)擴(kuò)增

3、產(chǎn)物為1 0 0 0 b p 和3 8 0 b p 。B 7 ．2 基因克隆及重組體鑒定，用T 7 ／S P 6 為引物進(jìn)行P C R ，擴(kuò)增序列長(zhǎng)度為1 1 0 0 一1 2 0 0 b p 之間，說(shuō)明得到陽(yáng)性重組子p G E M —T —B 7 ．2 。h T E R T 基因克隆及重組體鑒定，用h T E R T 自身引物進(jìn)行P C R ， 擴(kuò)增序列長(zhǎng)度為3 8 0 b p ， 說(shuō)明得到陽(yáng)性重組子p G E 卅T —h T E R

4、 T 。B 7 ．2 基因真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建及重組體鑒定，用B 7 ．2 自身引物進(jìn)行P C R ，擴(kuò)增序列長(zhǎng)度為l o o O b p ，說(shuō)明得到陽(yáng)性重組子p E G F P —C 3 一B 7 ．2 。p G E M —T _ h T E R T 、p E G F P —C 3 一B 7 ．2 兩質(zhì)粒的酶切片段電泳，雙粘h T E R T 序列長(zhǎng)度為3 8 0 b p ，雙粘P E G F P —C 3 一B 7 ．2 序列長(zhǎng)度為2

5、0 0 0 b p 以上。p E G F P —C 3 一B 7 ．2 一h T E R T 質(zhì)粒擴(kuò)增及P C R 鑒定，用h T E R T 自身引物進(jìn)行P C R ，擴(kuò)增序列長(zhǎng)度為3 8 0 b p ， 說(shuō)明得到陽(yáng)性重組子p E G F P —C 3 一B 7 ．2 咱T E R T 。插入片段測(cè)序結(jié)果與G e n B a n k 公布的相應(yīng)基因完全一致。p E G F P —C 3 一B 7 ．2 ．h T E R T 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染C

6、 H 0 細(xì)胞及熒光蛋白表達(dá)，C H O 細(xì)胞表面出現(xiàn)高密度的綠色熒光。由于p E G F P —C 3 載體外源基因與水母綠色熒光蛋白基因是在同一個(gè)啟動(dòng)子( C M V ) 下，表達(dá)的是同一融合蛋白，故見(jiàn)到綠色熒光就說(shuō)明外源基因B 7 ．2 和h T E R T 也高效表達(dá)。結(jié)論：本課題成功構(gòu)建出B 7 ．2 ／h T E R T 真核重組表達(dá)載體，并在C H O 細(xì)胞中成功表達(dá)，為進(jìn)一步探討以B 7 ．2 和h T E R T 為靶