1、多年來，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中我們大量使用有機(jī)磷農(nóng)藥，雖然有效保障了糧食果蔬的產(chǎn)量，但也導(dǎo)致了有機(jī)磷農(nóng)藥殘留及環(huán)境污染。使得大氣、土壤、水體等環(huán)境都遭到了不同程度的污染，嚴(yán)重危害了人類的生命安全。高效清除環(huán)境中殘留的有機(jī)磷農(nóng)藥已經(jīng)成為目前研究的熱點(diǎn)。利用微生物降解有機(jī)磷農(nóng)藥是一種安全、有效并且廉價的降解有機(jī)磷農(nóng)藥的方法，并且因其無殘留、無毒害、無二次污染而受到廣泛關(guān)注。有機(jī)磷農(nóng)藥與降解酶結(jié)合發(fā)生酶促反應(yīng)是一個十分快速的過程，但是大部分有機(jī)磷降

2、解酶為胞內(nèi)酶，這就使得有機(jī)磷進(jìn)入細(xì)胞的過程成為限速步驟，嚴(yán)重限制著降解速率。增強(qiáng)菌株對酶的分泌能力能夠很好解決這一問題。
　　本研究以有機(jī)磷農(nóng)藥降解菌施氏假單胞菌YC-YH1為實(shí)驗材料，從菌株YC-YH1中克隆得到了兩個有機(jī)磷降解酶基因mpd和ophc2。將這兩個基因分別連接到表達(dá)載體pET-32a上得到重組質(zhì)粒pET-mpd和pET-ophc2，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行表達(dá)。甲基對硫磷水解酶(MPH)和有機(jī)磷水解

3、酶(OPHC2)分別通過 Ni親和層析柱進(jìn)行純化，并進(jìn)行了酶學(xué)性質(zhì)分析，研究表明MPH最高活力的反應(yīng)溫度為40℃，在pH8-12范圍內(nèi)，酶均表現(xiàn)出較高的活力；OPHC2的最適反應(yīng)溫度為30℃，在pH8-12范圍內(nèi)酶活力較高；兩種酶按1:1比例混合組成的混合酶在溫度30℃-40℃范圍內(nèi)酶活力很高，保持在最高酶活力95％以上，混合酶在pH8-12范圍內(nèi)仍具有較高活力；多種金屬離子會對酶活性產(chǎn)生一定影響，酶對 SDS和 EDTA敏感度很高，混

4、合酶對于金屬離子的敏感性低于單個酶對金屬離子的敏感性。
　　此外，本研究從大腸桿菌中克隆得到TorA雙精氨酸信號肽編碼序列sTorA，構(gòu)建了pHSG299(sTorA-mpd)克隆載體，建立并優(yōu)化施氏假單胞菌的電轉(zhuǎn)化方法，利用電擊轉(zhuǎn)化的方法改造了菌株YC-YH1，并對MPH的周質(zhì)分泌功能進(jìn)行了測定。實(shí)驗結(jié)果表明轉(zhuǎn)化后菌株與野生型菌株相比，胞外酶活力提高36.4%，48 h內(nèi)菌株降解能力提高了8.7%，12h內(nèi)上清液的降解能力提高了