1、【研究背景】
　　頜面部骨組織的缺損通常都由外傷、腫瘤或是先天性疾病造成。骨再生是骨缺損修復(fù)的重要手段和發(fā)展方向。目前臨床多采用自體骨移植或者誘導(dǎo)骨組織再生（guided bone regeneration, GBR）的方法來修復(fù)頜面部骨組織的缺損。但自體骨移植供體有限，且容易發(fā)生缺血壞死，而 GBR技術(shù)僅局限于少量骨組織的再生，遠不能滿足臨床治療需求。同時這兩種治療技術(shù)可能會引起炎癥反應(yīng)而導(dǎo)致移植物吸收移植失敗。
　　近年

2、來干細胞技術(shù)成為骨再生的研究熱點。從發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow stem cells, BMSCs）到成功地在動物模型中生成骨組織，研究者們對BMSCs的研究不斷的取得進展?；诖?，研究人員又探索開發(fā)出新的干細胞，如脂肪間充質(zhì)干細胞（adipose-derived stem cells, ADSCs）,牙髓干細胞（dental pulp stem cells, DPSC），牙周膜干細胞（periodontal liga

3、ment stem cells, PDLSCs）等等，大大提升了組織再生的效果。而在軟骨內(nèi)成骨的過程中，參與的干細胞聚集并形成軟骨導(dǎo)板，并在此基礎(chǔ)上發(fā)生細胞的肥大化、血管化進而礦化、骨化。成軟骨細胞分化的干細胞分泌成血管因子和相關(guān)趨化因子并募集宿主的細胞參與軟骨導(dǎo)板的礦化和血管化的骨重建。大量軟骨組織工程研究證實，骨髓間充質(zhì)干細胞來源的成軟骨細胞聚集成細胞簇后增強了其軟骨形成的能力。在細胞之間的相互連接和細胞與基質(zhì)之間的相互作用調(diào)節(jié)下，

4、BMSCs來源的成軟骨細胞的重塑能力因為外源性的生長因子的參與而較單純的支架干細胞移植加強了。
　　目前已有的研究中為了實現(xiàn)骨缺損修復(fù)通常都是采用羥基磷灰石、三磷酸三鈣等生物陶瓷來充當(dāng)骨替代品，但這些人工合成的生物材料在人體內(nèi)降解速率很低，與宿主本身的骨組織的融合情況也不佳，而且很容易引起炎癥反應(yīng)導(dǎo)致移植失敗，而患者也為此要承受多次手術(shù)的創(chuàng)傷。因此開發(fā)一種微創(chuàng)的、低免疫排斥的以及可以很好的塑型的骨替代品是目前很值得期待的治療方法。

5、顆?；拿摷毎浌腔|(zhì)（particulate decellularized cartilage matrices, PDCM）支架，本身來源于有機體，取材豐富，在去除細胞后保留了原有的細胞外基質(zhì)及基質(zhì)內(nèi)含有的生長因子，極其有利于組織的再生。此外去除細胞后，多孔狀的三維結(jié)構(gòu)有利于細胞和生長因子的附著，便于后期血管的長入，為骨再生過程中的血管化提供了很好的空間結(jié)構(gòu)。其本身因為保留了細胞外基質(zhì)而使支架具有了一定的機械強度。
　　作為組

6、織工程三要素之一的生長因子也是必不可少的。當(dāng)前的研究中應(yīng)用較多的是骨成型蛋白（bone morphology protein, BMP）。該蛋白表現(xiàn)出較好的促成骨和成軟骨能力，但由于提取及提純成本高，大大增加了臨床應(yīng)用的成本。水凝膠雖然保留了一定的化學(xué)和機械性能，但與干細胞共同植入體內(nèi)后的效果仍然差強人意，不時伴有炎癥反應(yīng)，中央壞死等。富血小板血漿（platelet rich plasma, PRP）中富含600多種生長因子，這些生長因

7、子可以大大促進血管生成以及骨重建。而且PRP可以從自體提取，不僅保證了來源更降低了應(yīng)用的免疫排斥反
　　應(yīng)，因而逐漸成為近年來骨再生研究中的“明星因子”。
　　因此本實驗提出利用成軟骨誘導(dǎo)的BMSCs細胞膜片碎化再復(fù)合PDCM和PRP成為可注射性的凝膠狀混合物通過軟骨內(nèi)成骨的過程實現(xiàn)骨再生。這項技術(shù)不僅使實驗操作更為簡便，減少了對動物的創(chuàng)傷，更為以后臨床轉(zhuǎn)化為微創(chuàng)操作提供可能，為骨的再生提供一種全新方法。
　　【目的】

8、
　　探討應(yīng)用經(jīng)成軟骨誘導(dǎo)的BMSCs膜片碎塊（bone marrow stem cells bricks, CB）與PDCM以及PRP復(fù)合通過軟骨內(nèi)成骨構(gòu)建可注射性組織工程骨的可行性。
　　【方法】
　　1.BMSCs細胞膜片的培養(yǎng)及鑒定：全骨髓貼壁法分離培養(yǎng)兔BMSCs成膜片并進行成軟骨誘導(dǎo)，剪碎。對培養(yǎng)好的細胞膜片分別進行電鏡掃描（scanning electron microscope, SEM），番紅O染色，

9、實時定量逆轉(zhuǎn)錄聚合鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real time reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）檢測其成軟骨和肥大相關(guān)基因表達。
　　2.PDCM支架制備及鑒定：剪取新鮮兔耳，粉碎后，1％十二烷基硫酸（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide, SDS）化學(xué)方法脫細胞。對PDCM分別進行掃描電鏡觀察，蘇木精-伊紅染色（Hematoxyl

10、in-eosin staining，HE），番紅O染色，二型膠原免疫組織化學(xué)染色，以及膠原總量（COL, collagen）和糖胺多糖（glycosaminoglycan, GAG）總量的定量檢測。
　　3.PRP制備：取新鮮兔耳動脈血兩次離心制備PRP。
　　4.裸鼠皮下移植實驗：將 BMSCs膜片碎塊與制備好的PDCM和PRP混合均勻，注射到裸鼠背部皮下。對照組裸鼠皮下注射PDCM和PRP混合物。分別在植入4周,12周時

11、取材，對樣本進行濕重、體積、厚度等大體觀察以及組織學(xué)染色等方法評價。
　　5.兔子脛骨頭種植體周圍骨缺損模型修復(fù)：將來自同只兔子骨髓培養(yǎng)的BMSCs經(jīng)成軟骨誘導(dǎo)后成膜并剪碎與PDCM和PRP混合注射到新西蘭大白兔脛骨上種植體周圍骨缺損中，以PDCM和PRP混合物為對照組，12周后取材，進行Micro-CT、組織學(xué)等檢測。
　　6.采用 SPSS20.0統(tǒng)計軟件對實驗中的相關(guān)數(shù)據(jù)進行方差分析或者是隨機分組的兩組間均值t的檢驗。

12、
　　【結(jié)果】
　　1.BMSCs成乳白色膜片，可用器械夾持，具有一定的厚度，SEM鏡下和番紅O染色結(jié)果顯示 BMSCs膜片有多層細胞和豐富的細胞外基質(zhì)沉積，并通過細胞外基質(zhì)相互交聯(lián)，RT-PCR結(jié)果顯示 BMSCs初步肥大化并表達了相關(guān)基因如 COL-I、COL-X以及血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）等。
　　2.HE和番紅O染色結(jié)果顯示PDCM經(jīng)過

13、脫細胞后除去了細胞只剩余細胞外基質(zhì)構(gòu)成的多孔結(jié)構(gòu)，膠原和糖胺多糖的定量檢測結(jié)果顯示，PDCM保留了大量的膠原和糖胺多糖,體視顯微鏡和掃描電鏡下PDCM直徑200μm左右，可使其順利通過16G注射器針頭。
　　3.裸鼠皮下實驗證實顆粒化的脫細胞軟骨-BMSCs細胞膜片碎塊-富血小板血漿（ particulate decellularized cartilage matrices-BMSCs bricks-platelet rich

14、plasma, PDCM-CB-P）復(fù)合物可以實現(xiàn)早期（4周）快速血管化，CD-31熒光染色中可見大量血管樣結(jié)構(gòu)，同時COL-I和COL-X等軟骨內(nèi)成骨的膠原逐漸增多，天狼星紅染色顯示，新生成的COL-I和COL-X在不斷的增多，并在12周時HE和馬松三染色都顯示生成了了大量的類骨質(zhì)基質(zhì)和骨組織，而對照組則在4周時血管化很差， CD-31熒光染色中幾乎看不到內(nèi)皮細胞的標(biāo)記，在12周時HE和馬松三染色中也未見明顯成骨，且免疫組化染色結(jié)果顯

15、示COL-I和COL-X低表達。
　　4.兔子脛骨頭種植體周圍骨缺損修復(fù)實驗證實，注射的PDCM-CB-P復(fù)合物經(jīng)過體內(nèi)12周的時間后其中的PDCM比對照組PDCM-P中的PDCM更快的被骨組織所代替。Micro-CT結(jié)果顯示PDCM-CB-P組比PDCM-P組在種植體周圍生成了更多的骨組織，同樣的苦味酸-酸性品紅染色（vangieson, VG）也顯示PDCM-CB-P組在種植體周圍形成了更多的骨組織并結(jié)合更緊密，而 HE和馬松

16、三染色則可見PDCM-CB-P組種植體周圍有較多松質(zhì)骨生成，幾乎未見PDCM,而PDCM-P組則生成了較少的松質(zhì)骨同時仍然可見較多的PDCM。
　　【結(jié)論】
　　1.成軟骨誘導(dǎo)后的BMSCs細胞膜片、PDCM以及PRP的復(fù)合物可注射并很好地維持了注射后包塊的形貌和體積,具有很好的支撐性。
　　2.PDCM-CB-P復(fù)合物實現(xiàn)了早期快速血管化并很好的實現(xiàn)成骨。
　　3.PDCM-CB-P復(fù)合物實現(xiàn)了種植體周圍缺損快