1、中華醫(yī)學雜志 2 0 0 4年 8月 1 7日第 8 4卷第 l 6 期 N a t [ M e dJC h i n a ， A u g u s t1 7 ， 2 0 0 4 ， V o l8 4 ， N o ． 1 6K R T 6 A基 因 I 4 6 2S新 生 突變導致 I 型先天性厚 甲癥 康曉靜 孫森 楊威 于敏 鞠強羅會元 夏隆慶 張學【 摘要】目的 研究 I 型先天性厚 甲癥患者 K R T 6 A基因突變情況， 為建立

2、該病的基因診斷與 遺傳咨詢提供依據(jù)。 方法 提取 1 例 I 型先天性厚 甲癥患者及家系成員和 5 0名正常對照外周血 白細胞基因組 D N A ， 設計針對 K R T 6 A基因的特異引物， 采用聚合酶鏈反應( P C R) 擴增基因的全部編碼 序列， D N A直接測序明確具體的突變位置和方式， 限制性內(nèi)切酶反應驗證基 因突變。結果 P C R結 合 D N A測序發(fā)現(xiàn)患者 K R T 6 A基因第 7 外顯子存在異常 ； 第 1

3、 3 8 5位核苷酸 由胸腺嘧啶( T ) 突變?yōu)轼B嘌 呤( G ) ， 導致 K R T 6 A角蛋 白 2 B螺旋 區(qū)末端第 4 6 2 位密碼 子 由異亮 氨酸 ( I ) 變成絲氨 酸 ( S ) ， 即發(fā)生 I 4 6 2 S 錯義突 變 ?；颊?父母及 與家系無 血緣關 系的 5 0名正常 對 照均 未發(fā) 現(xiàn)此 突變 ， 提示 I 4 6 2 S為一 種新 生突變 ( d en o v om u t a t i o n )

4、。 結論 K R T 6 A基因 I 4 6 2 S 新生錯 義突變是 導致該 例患 者 I 型先 天性 厚 甲癥 的特異突變 ?！?關鍵詞】 皮膚疾病， 遺傳性 ； K R T 6 A基因； 角蛋白； 突變， 誤義 A d en o n ol 6 2 Smu t a t i o ni nt h eKRT6 A g e n ei sa s s o c i a t e dwi t hp a c h y o n y c hi ac o

5、n g e n i t a t y p eIGX i a o - j i n g ’ ，J sM i a o ，^ r G，Mi n ，I ，Q i a n g ，o nH，A一 q i n g ，z H A N GX． ’ I n s t i t u t eo fD e r m a t o l o g y ．C h i n e s eA c a d e m yo f Me d i c a lS c i e n c e S＆ P

6、e k i n gU n i o nMe d i c a lC o l l e g e ． № n j i n g2 1 02． C ^ i n aC o r r e s p o n d i n ga u th o r ：X I AL o一 q i n g， E m a i l ： x i a l q i n g @p u l b i c 1 ． p t t ． j s ． c a【 A b s t r a c t 】O b j e c

7、 t i v eT oa n a l y z et h eKI ’ 6 Ag e n em u t a t i o na n dm u t a t i n gp a t t e r n si nas p o r a d i cC h i n e s ep a t i e n tw i t hP a c h y o n y c h i ac o n g e n i t a( P C) 一 1s oa st op r o v i d eab

8、 a s i sf o rg e n ed i a g n o s i sa n dg e n e t i cc o u n s e l i n go ft h i sd i s o r d e r ． M e t h o d sG e n o mi cDN A w a s e x t r a c t e df r o m w h o l eb l o o db ys t an d a r dme t h o d sf r o m

9、 af e ma lep a t i e n tw i t hP C一 1a n dh e rp a r e n t s ．a(chǎn) n df r o m 5 0n o r ma 1 ．u n r e l a t e di n d i v i d u a ls ． P r ime r sf ors p e c i f i ca mp l i f i c a t i o no ft h es t r u c t u r a lKRI l 6

10、 A g e n ew i t h o u tc oa mp l i f i c a t i o no fh o mo l o g o u sg e n e sw e r ed e s i g n e da n ds y n t h e s i z e d ．Al le x o n so ft heg e n ea n dt he i rf l a n k i n gi n t r o n i cs e q u e n c e swe

11、 r ea m p l i f i e du s i n gp o l y m e r a sec h a i nr e a c t i o nfP C R)a n ds u b j e c t e dt oa u t o m a t i cD N As e q u e n c i n g ．T h emu t a t i o nw a s c o n f i r m e db vMb 0Ir e s t r i c t i o nd

12、 i g e s t i o no ft heKRT 6 A— s p e c i f i cP CRp r o d u c t s ．Re s u l t sDi r e c ts e q u e n c i n go ft h eP CRp r o d u c t sr e v e a le dan o v e lh e t e r o z y g o u smi s s e n s emu t a t i o n．I 4 6 2S

13、i nt h eKⅣr 6 Ag e n e．w h i c hr e s u lt e df r o m Tt oGt r a ns v e r s i o na tn u c l e o t i d e1 3 8 5( 1 3 8 5 T>G)i ne x o n7w a s d e t e c t e di nt h ep a t i e n t ．T h i sm u t a t i o nw o u l dr e s

14、 u lti nt hes u b s t i t u t i o no fI s o l e u c i n eb yS e r i n ea tc o d o n4 6 2 ( I 4 6 2 S )l o c a t e di nt hee n d2 Bd o m a i no fk e r a t i n6 A． Nos u c hmu t at i o nwa s f o u n di nt hep a t i e n t

15、， sp a r e n t sb ys e q u e n c i n go fP CRp r o d u c t sa n dt hi smu t at i o nwa sc o n f i r m e di nt hep a t i e n ta n de x c l u d e df r o m b o t h p a re n t sa n d5 0n o r l n a l ，u n r e l a t e dc o n

16、 t r o l sb yr e s t r ic t i o na n a ly s i so fP CRf r a g me n t su s i n gMb oIe n z y me ． Co n c l u s i o n sAd en o v omi s s e n s emu t a t i o ni n山eK I 1 5 Ag e n e ． I 4 6 2 S． h a s b e e nf ou n di nas p

17、 o r a d i cPC 一 1p a t i e n t ． T h ei d e n t i f i c a t i o no ft h i sn o v e lmu t at i o ni nt h eKR T 6Ag e n ep r o v i d e sf u r t h e re v i d e n c et h a tmu t a t i o ni nt heKRT 6Ag e n ec a u s e sP C一

18、1p h e n o t y p e ．【 K e yw o r d s 】S k i nd i s e a s e s ， g e n e t i c ； t h eK Ⅳr 6 Ag e n e ；K e r a t i n ；M u t a t i o n ， m i s s e n s e基 金項 目： 國家 高技術研 究發(fā)展 計劃 ( 8 6 3 計 劃 ) 基 金 資助項 目( 2 0 0 1 A A 2 2 11 0 1

19、、 2 0 0 2 B A 7 11 A 0 7 - 0 9 ) ； 美 國中華醫(yī)學基金會基 金資助 項 目( 0 3 ~8 5 )作者單位 ： 2 1 0 0 4 2南京 ， 中 國醫(yī)學 科學 院中 國協(xié) 和醫(yī)科 大學 皮 膚病研究所 ( 康 曉靜 、 鞠強 、 夏 隆慶) ； 中國醫(yī)學科 學院 中國協(xié) 和醫(yī)科 大學基礎醫(yī)學研 究所醫(yī) 學遺傳 學 系 醫(yī)學分 子 生物學 國家 重點 實驗 室( 孫淼 、 楊威 、 于敏 、 羅會元 、

20、 張學)通訊作者： 夏隆慶， 電子信箱 ： x i a l q i n g @p u l b i c 1． 臨床論 著 先天性厚 甲癥 ( p a c h y o n y c h i ac o n g e n i t a ， P C ) ， 又 稱先天性厚 甲綜合征 ， 是一 種常染色體顯性 遺傳性 皮膚病 ， 臨床表現(xiàn) 主要為指 ( 趾 ) 甲過度 角化增 厚 ，甲營養(yǎng)不 良及其他外胚葉缺陷的癥狀 。根據(jù)臨床表 現(xiàn)主要分 為兩 型 ，

21、I型先 天性 厚 甲癥 ( P C ． 1 ， 又稱 L a d a s s o h n — L e w a n d o w s k y 綜 合征 ， M I M1 6 7 2 0 0 ) 和 Ⅱ型先 天 性 厚 甲癥 ( P C - 2 ， 又 稱 J a c k s o n ． L a w l e r綜合 征 ， M I M1 6 7 2 1 0 ) 。國外研 究 指 出 P C ． 1為角 蛋 白 維普資訊 http://www.

22、cqvip.com 華醫(yī)學雜志 2 0 0 4年 8月 1 7日第 8 4 卷第 l 6期 N a i lM e dJC h i n aA u ~ a s t 1 7 ． 2 0 0 4 ． V o l8 4 ．n1 6K i t 純化回收( 德國 Q I A G E N公司)純化產(chǎn)物送 至 大連寶生物有限公司用 A B I 3 7 7型 D N A全 自動測序 儀進行測序 。測序樣本為患者和患者表型正常的父 母。 測序結果與 基因庫中

23、 提供的 K R T 6 A 基因序列進行對 比5 ． 限制性內(nèi)切酶酶位分析： 用于鑒定變異基因在家系中的分布情況 ， 或?qū)φＨ巳哼M行多態(tài)性分 析 ?；颊呒盎颊吒改?和正常 對照 K R T 6 A基 因第 7外顯子 P c R產(chǎn)物經(jīng) 5UM b ol 酶 ( 大連寶生物有限 公司) 消化 2h ， 2 ％瓊脂糖凝膠電泳檢測。4 ) 。說明患者父母及與家系無血緣關系的正常人在 此位點均為正常等位基因純合子 ， 不存在突變 結 果 l

24、 - P C R擴 增 ： 患 者 、 患 者 父母 K R T 6 A基 因組 D N A擴增出 目的片段 的長度 為 5 3 2—1 4 9 6b p ， 結果 B見 圖 2 。外顯于外顯子外置于 M 1M 2 —4M 5 —6穗 II 二-l●■M： D N A分子量標 準為 D L 2 0 ( ] O圍2K R T 6 A基因第 1 — 9 外顯于 P E R擴增 產(chǎn)物電泳圈2 ． D N A直接測序 ： K R T 6 A所

25、有 外顯 子 P C R擴 增后直接測序 ， 發(fā)現(xiàn)患者 K R T 6 A基因第 7外顯子存 在雜合錯義突變 ： 第 1 3 8 5位堿基 ( 以起始密碼 A 1 ℃之 A為第 1 位) 胸腺嘧啶( T ) 突變?yōu)轼B嘌呤 ( G) ， 即1 3 8 5 T>G ； 導致 A T C — A G C密碼 子的改 變， 使 得 4 6 2 位氫基酸從異亮氨酸 ( I ) 突變?yōu)榻z氨 酸( s ) ， 即I 4 6 2 S 。其父 母

26、D N A的 P C R產(chǎn)物經(jīng)測 序未發(fā)現(xiàn)此 突變 。圖 3 示 I 4 6 2 S ( 】 3 8 5 T> G ) 突變和正常野生型的鍘序結果。3 ．限制 性 內(nèi)切 酶 酶 切 分析 ： K R T 6 A 基 因 的 I 4 6 2 S ( 1 3 8 5 T> G ) 突變造成限制性內(nèi)切酶 M b oI 識 別位點( 5G A T C3) 的破壞， 患者發(fā)生突變的等位 基因不能被 t ' V l b oI 切

27、開而保留一條4 1 2b p 的 長片 段，而正常的等位基因被切成 1 6 2b p和 2 5 0b p的2 條短 片段。用這種方法檢測患者 的父母及與家系無血緣 關系的正常對照均顯示可以梭切成 2條短片段 ( 圖 AP C患者 n L 1 3 8 5T _ +G雜臺突變， 4 6 2 位碼 子 A T C— A G C ， 異 亮 氟 酸 教 絲 氫 酸 替 代 ( 1 4 6 2 5 ) ； B 正常序列 n L1 3 8 5 為純

28、和T ， 橫線 為讀碼框 圖3K R T 6 A基因第7 外顯子測序結果 ( 箭頭 示突變位置 )毒 一 4 1 22 5 01 6 Z4 ． 1 22 5 01 6 2A ： MD N A分子量標準； 1 — 3 ． 酶切前P C患者父親、 患者 母親及患者電禱 = 圖； 4— 6酶切后 P c患者父親、 患者母 親及患者電泳圍 P c患者多 J 條 4 1 2b p 沒有被酶切的片段 B ： I 一9 ．正常人 酶切后 電泳 圈；