1、3 8 0[ 文章編號] 1 0 0 0 — 2 2 0 0 ( 2 0 0 5 ) 0 5 — 0 3 8 0 — 0 3JB e n g b uMe dC o l l ， S e p t e m b e r2 0 0! V 0． 三 Q !Q ：N o g o 一 6 6蛋 白氨基酸肽 的克隆及在原核細胞 的表達 陳昌杰 ， 章 堯 · 基 礎(chǔ) 醫(yī)學(xué) ·[ 摘要] 目的： 克隆編碼 N o g o - 6 6 氨

2、基酸多肽基因， 構(gòu)建原核重組表達載體， 并誘導(dǎo)其在大腸埃希菌 B I 2 1 ( D E 3 ) 中表達。方法：逆轉(zhuǎn) 錄聚合酶鏈反應(yīng) ( R T - P C R ) 方法擴增 出編碼 N o g o 蛋 白環(huán)外一 6 6 氨基酸多肽基 因 ， 將其克隆 于 T載 體 P M D 1 8 一 T， 酶 切鑒定 后再亞 克隆于原核表達載體 p E T - 4 2 a ( + ) ， 酶切及 測序證實序列正確后 ， 轉(zhuǎn)化大腸埃希菌 B L 2

3、 1 ( D E 3 ) ， 經(jīng)異 丙基硫代一 p D半乳 糖苷( I F r I ' G ) 誘導(dǎo)表達融合蛋 白一 N o g o - 6 6 。結(jié)果： 克隆了編碼 N o g o 蛋 白環(huán)外． 6 6 氨基 酸多肽基因 ， 構(gòu)建 了融合 蛋 白的重組表達 質(zhì)粒 ， 融合蛋 白的表達隨著時間延長增加 。結(jié)論 ： 獲得 了編碼 N o g o 蛋 白環(huán)外一 6 6 氨基 酸多肽基 因及其 原核 表達產(chǎn) 物 ， 對 研究 N o

4、g o 蛋 白的生物 學(xué)功能及其 m A b 的制備奠定基 礎(chǔ)?！?關(guān)鍵詞 ] N o g o 蛋白 ； 克隆 ； 原核細胞 [ 中國圖書資料分類法分類號] Q5 9 3 ． 2 ； R3 9 4 ． 3[ 文獻標(biāo)識碼] ACl o n i n ga n de x p r e s s i o no fn o g o - 6 6p r o t e i ni np r o k a r y o t i cc e l l sC H E NC h

5、 a n g - J i e ， Z H A NGY a o( D e p a r t m e n to fB i o c h e mi s t r ya n dMo l e c u l a rB i o l o g y， B e ~ e , 6 uMMi c a lC o l l e g e ， 1 3 e ~ g b u2 3 3 0 0 3 ， C h i n a)[ A b s t r a c t ] O b j e c t i

6、 v e ： T oc l o n eN o g o - 6 6g e n e ， c o n s t r u c tt h er e c o m b i n a n tp r o k a r y o t i ce x p r e s s i v ev e c t o ra n de xp r e s si t sp r o d u c t si nE．c o l i ． Me t h o d s ： N o g o - 6 6g e

7、n ew a sa mp l i f i e db yr e v e r s et r a n s c r i p t i o np 。 1l e r a s ec h a i nr e a c t i o n( R T — P C R)a n dt h e nc l o n e d i n t oP MD 1 8 一 T v e c t o r ． A f t e ri d e n t i f i e d b yt h ee n

8、 z y med i g e s t i o n ， t h eg e n ewa s s u b c l o n e d i n t op r o k a r y o t i ce x p r e s s i v ev e c t o rp E T- 4 2 a ( +) ，w h i c hwa s i d e n t i f i e d b yt h ee n zy m ed i g e st i o na n ds e

9、q u e n c i n g ． N o g o - 6 6f u s i o np r o t e i nw a s e x p r e s s e di nE． c o l iB L 2 1 ( D E 3 )b yI P T G．Re s u l t s ： Th eNo g o - 6 6g e n ea n dr e c o mb i n a n tp r ok a r y o t i ce x p r e s s i o

10、 nv e c t o rwe r eo b t a i n e d a n dt h eNo g o - 6 6p r o t e i nwa s e x p r e s s e da n di n c r e a s e dwi t hp r ol o n go ft i me ． Co n c l u s i o n s ： Th eNo g o - 6 6e x p r e s s i o nv e c t o ra n d

11、i t sp r ok a r y o t i ce x p r e s s i o np r o d u c twe r eo b t a i n e d ． I tma y b eh a s ag r e a ts i g n i f i c a n c ef o rs t ud yt h eb i o l o g i cf u n c t i o no fNo g o - 6 6p r o t e i na n dt h ep

12、r e p a r a t i o no fmo n o c l o n a la n t i b o d ya g a in s tNo g o - 6 6p r ot e i n ．【 K e yWO l d S ] No g o - 6 6p r ot e i n ； c l o n i n g， m o l mA a r ； p r ok a r y o t i cc e l l s[ 收稿 日 期 ] 2 0 0 5 — 0

13、3 — 1 6[ 基金項 目] 安徽省教育廳 自然科學(xué)研究資助項 目( 2 0 0 1 k j 1 6 9 )[ 作者單位 ] 蚌埠 醫(yī)學(xué)院 生 物化學(xué) 與分子生物學(xué) 教研室 ， 安徽 蚌埠 23 3 0 0 3[ 作者簡介 ] 陳昌杰 ( 1 9 6 8 一) ， 男 ， 安徽靈璧縣人 ， 博士， 副教授 ．2 0 0 0 年 國外三個 實驗室 同時克隆 了抑 制受損 神經(jīng)再生 的 N o g o基 因， 該基 因編碼 的蛋 白分子有

14、 三種異構(gòu)體 ， 分別命名 為 A、 B 、 C 【～ 引， 即 N o g o - A 、N o g o - B和 N o g o - C ， 長度分別為 11 6 3 、 3 6 0和 1 9 9 個 稱為 T細胞生長因子 ， 作用于包括 T細胞 、 B細胞 、N K細胞 以及 巨噬細胞在 內(nèi)的很 多免疫細胞 ， 促進 它們的增殖、 分化和效應(yīng)的發(fā)生。但 7細胞產(chǎn)生 I L - 2比 a細胞慢， 我們認為有以下兩種可能： ( 1 )

15、兩類細胞在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方面差異 ， 7細胞充分 活化 的“ 門檻” 較 細胞高或者時間比 a p ] r 細胞長 ， 因為 I L - 2 的表達是 T細胞完全活化的一個標(biāo)志； ( 2 )導(dǎo)致 I L - 2 和 I F N 一 7 兩類細胞因子表達 的信號要求 也不一樣 。具體的細節(jié)尚待進一步研究。[參考 文 獻 ][ 1 ] 胡建國 ， 侯彥強 ， 陳 勇， 等 ． Mt b A K 細胞與 C ' ~ A K 、 L A K

16、細 胞體外增殖 和殺 瘤活 性 比較 [ J ] ． 蚌埠 醫(yī)學(xué)院 學(xué)報 ， 2 0 0 1 ， 2 6( 5 ) ： 3 7 7 -3 7 9 ．[ 2 ] 吳俊英 ， 李柏青 ， 張學(xué)光 ， A P C在結(jié)核 桿菌低分 子多肽抗 原體 外激活人外周血 7 5 “ 2 “ 細胞 中的作用 [ J ] ． 細胞與分子 免疫 學(xué)雜 志， 2 0 0 1 ， 1 7 ( 5 ) ： 4 9 2 -4 9 4 ．[ 3 ] 吳 俊英 ， 李柏

17、 青 ， 侯彥強 ， 等． P I 3 K在 T C R和 ( = D 2 8協(xié)同激 發(fā)的 7 b ' T細胞活化信號轉(zhuǎn) 導(dǎo)中的作用 [ J ] ． 中華微 生物學(xué)和免 疫 學(xué)雜志， 2 0 0 3 ， 2 3 ( 2 ) ： 1 2 3 ～1 2 6 ．[ 4 ] 侯彥強 ， 李柏青 ， 胡建 國， 等 ． 結(jié)核桿 菌抗 原特異性 激發(fā) 人 7 8 7 “細胞活化信號涉及 R a s ／ E r k途徑 [ J ] ． 中國免

18、疫 學(xué)雜志 ， 2 0 0 3 ，1 9 ( 8 ) ： 5 3 0 ～5 3 3 ，[ 5 ] 呂合作 ， 陳 勇 ， 吳俊英 ， 等 ． 結(jié)核桿 菌抗原活化 的 7 8 “ 1 “ 細胞 中Z A P 一 7 0 的酪氨酸磷 酸化 特點 [ J ] ． 中華微 生物 學(xué) 和免 疫 學(xué)雜志， 2 0 0 4 ， 2 4 ( 1 1 ) ： 8 7 4 -8 7 7 ．[ 6 】 I 3 a r a nJ ． K o w a l c z

19、 y kD ， 0 z o gM， e ta 1 ． T h r e e - c o l o rf l o wc y t o m e t r yd e t e c t i o no fi n t r a e e l l u l a rc y t o k i n e si np e r i p h e r a lb l o o dmo n o n u c l e a rc e l l s [ J ] ． C ／ i n D i a g n

20、 l a b l m mu n o l ， 2 0 0 1 ， 8 ( 2 ) ： 3 0 3 -3 1 3 ．[ 7 ] 侯彥強， 吳俊英， 胡建 國， 等． 流式 細胞術(shù)檢測 “ ／ S T細胞 內(nèi)細胞 因子的方法學(xué)探討[ J ] ． 蚌埠醫(yī)學(xué)院學(xué)報 ， 2 ( D 2 ， 2 7 ( 5 ) ： 3 8 0 -3 8 3 ．[ 8 ] B o o m WH， ml a 5K N ， N a y a k R ， e ta 1 ． C

21、 h a r a c t e r i z a t i o no fa1 0t o1 4k i l o d a l t o np mt e a s e - s e n s i t i v eMy c o b a c t e r i u mt u b e r c u l o s i sH 3 7 R aa n t i g ∞ t h a ts t i mu l a t e sh u m a nTc e l l s [ J ] ． I n f

22、 e c tI m mu n ， 1 9 9 4 ， 6 2 ( 1 2 ) ： 55 1 1 ～55 1 8 ．【 9 JL a f o n tV， L i a u t a r dJ ， G r o s sA， e ta 1 ．Tu mo rn e c r o s i sf a c t o r - ap r o d u c t i o ni sd i f f e r e n t l yr e g u l a t e di na n d

23、h u ma nTl y mp h o e y t e s[ J ] ． J B i o lC h e m， 2 0 0 0 ， 2 7 5 ( 2 5 ) ： 1 92 8 2 ～1 92 8 7 ．維普資訊 http://www.cqvip.com 3 8 2JB e n g b uM e dGa l l ， S e p t e mb e r2 0 0，：!：：6 5 0 1 [- ∞ n 6 ∞ 0” Tc ∞ - 。 ：

24、c G。 m G = m韞w l糟i』 《止 姓△w16T0¨ 一 ：1c7。6T T=l c r l1：o6 c 。=20 。c2610c T G。 G TTT口 T 矗 搿 ．r 餮Ⅲ G!姒3△ 』r 引 5nt l l 益 I } 采 止 S I l 、I ， AI ．H i M 班 I i} n iu l．I5 ． I i 1 , 7 ¨ _2c十I ． ¨- l丸 l 霜 葉 晤

25、 十 Ih2 I -4 1 -3 討 論 N o g o蛋白具有抑 制受損神經(jīng)的 生 ， 該蛋白三 種異構(gòu)體是否都具有抑制 神經(jīng)再 生的作用 ． S c h w a b研究認為 ． No g o - A的氨基端是主要抑制區(qū)域： Wa l s h小組 電根據(jù)實驗結(jié)果得出分離 的氮基酸片段具有抑 制神經(jīng)再生作用結(jié)論 ； S t r i t t m a t t e r 實驗室研究 結(jié)果 顯示 ， N o g o - C的膜碎片亦同樣具有抑

26、 制種經(jīng)再生作 用。S t r i t t ma t t e r 實 驗 室發(fā)現(xiàn)介 導(dǎo) N o g o - 6 6抑 制神 經(jīng)再 生 的 受 體使 其 研 究 進 人 新 的 時 代_ 4J 。L i a o等_ 5 】 研 究表明 N o g o - 6 6 抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞 黏附和 遷移 ， 所以本實驗通 過基因重組 獲得 N o g o - 6 6多肽 具有重 要意 義。在成年 哺乳動物 ， N o g o - A主要分布于中樞

27、神經(jīng) 系統(tǒng) ( C N S ) 少突膠質(zhì) 細胞內(nèi)質(zhì) 剛， 只有極少 量位于 少突膠質(zhì)細胞表面 ， 在某些 神經(jīng)元膜上 或細胞內(nèi)也 有表 達 ， 脊 髓損 傷后 ， N o g o - Am R N A和 蛋 白增 加 ，N o g o - A在 視神 經(jīng)損 傷后 遠 近端 聚l 『 ’ 。N o g o - B、N o g o - C的分布較 N o g o - A廣泛。除 C N S外， N o g c ~ B在外周組織 如軟骨 、

28、腎臟 、 皮膚 、 肺及 脾中也有低水 平分布 ； N o g o - C在 C N S主要分布 于星形膠質(zhì)細胞 ，在外周組織 中大部分 存在 于骨骼 肌細胞 及脂肪 細胞 ， 心 肌巾也有 少量分 布。本實驗 根據(jù)文 獻- 【 _ 報道 的 N o g o 蛋 白的 c D N A序 列 ， 設(shè) i l引 物 ， 通 過 R T -P C R技術(shù)獲得編碼該蛋 白的親水性 6 6 氨 基酸基 因 片段 。由于原核表達 系統(tǒng)常受到 目的基

29、因本 身的結(jié)構(gòu) 特 點、 轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié) 和蛋 白質(zhì)水平等諸 多 因素的 影響 ， 使 目的基因在 原核表達 系統(tǒng) 的表 達成 為基因 工程技術(shù)的重要環(huán) 節(jié)和難點 之一。本實 驗中 ， 我們 采用 I n v i t r o g e n 公 司商品化 的 p E T - 4 2 a ( +) 融合表 達載體 ， 它是 一種較 為高效 的蛋 白表 達載體 ， 多克隆 位點之后依 敬有 G S T表位 和 6個組 氮酸的標(biāo) 鑒蛋 白， 方便

30、 檢測 與純化 ：更 重要的是， 載體帶有 阿米卡 星抗性基因 ． 可以利用 它進行篩 選 裝有 目的基 因表達載體轉(zhuǎn)化大腸埃希 苗后 ， 通過 S D S - 聚丙烯凝膠 電泳技術(shù) 、 發(fā) 現(xiàn)在 3 5k D a 蛋 白分子量處有特異 的蛋 白質(zhì)條帶 ， 這都問接地證明有 E 1 的蛋 臼的表達 ， 為下一 步單克 隆抗 體的制備和研究其生物學(xué)功 能奠定了基 礎(chǔ) 。【參 考 文 獻 ][ 1 ] C h e nMS ， H u l ,

31、 e rA B ． m d e rH a a rME ．“ N c x g o - Ai sⅡI1 a cn e u r l t eⅡ】gr ‘ Ihi ~ i b l m ra n da na r t tnf o rn ~ l n o c l o r l a l1 【 l I n】 yI N ． 1 [ J ] N a t n． 2 0 0 04 0 3 ( 67 6 8 ) ： 4 3 4 ～4 3 9[ 2 ] G ~ a n

32、 d p r e T． N a k a m~ aF ． V a ~ a n iTa 1 ． I d i o t i t [ c a t i o n o f t h eN c g oi n h i b i t o ro f∞ ~ g e n e r a t m n8m d c u i o np m t e l n [ j ]fr． 2 0 0 0， 4 D 3 ( 67 6 8 j ： 4 3 9～4 4 4[ 3 ： P n m h e

33、 R ． M o o r eS EV ? IM， e ta lI n h i b i t o rdn e u f i ~o m g m , ~ hmh[ J ] N a t u r e ， 2 0 ( N ． 1 0 3 ( 67 6 8 ) ： 3 8 3 -3 8 4[ 4G r a n d p r e T． L 1S ． S t n t i m a i t e r S M 6 6~ c e p t e r m ' ~

34、a g u n i s el x ' p i d vp r u ~ t e s? I a lr∞ ㈣ m Ⅲ tJ 】 N a t l ~ * - e ． 2 ( ) 【 ) 2 ． 4 1 7f 68 8 8 ) ： 5 4 7～ 5 5 1[ 5 ． L i r a H． L 址ar ． T , m gI W 6 6~ m ' d i lⅧ c 剛 g l y o c i f i r o r e i n( 州)

35、ml t i l ~ tt h e , a d h ~k , na n dm。?N， 6 6r t ~p t o r∞ gh mⅫ dJ 1Jh e m。J．】 t 5 ) ： t1 5 6～ 】1 旺 C 6 ] l - l ~ n tD ． C o f f i nR S． P n n j h aR K ．NL , g o ． Ae x p r e ． ~ i o ni nt h ei n t a c tdi n j u r e