1、細胞培養(yǎng)標準操作程序（SOP) SOP)1．目的 ．目的：為了保證培養(yǎng)細胞的正常生長，實驗技術人員必須明確并正確執(zhí)行細胞培養(yǎng)的基本操作步驟，特制訂實驗室細胞培養(yǎng)操作流程。2．適用范圍： ．適用范圍：適用于來我院細胞室進行細胞培養(yǎng)工作的人員.3．操作規(guī)程： ．操作規(guī)程：3。1 培養(yǎng)液、 培養(yǎng)液、PBS、胰蛋白酶的配制 、胰蛋白酶的配制3。1.1 1000ml 培養(yǎng)液的配制 培養(yǎng)液的配制1、準備用品:培養(yǎng)粉、1000ml 燒杯、玻棒、量

2、筒、電子分析天平、PH 儀、2～3 天內的新鮮三蒸水（或新鮮反滲水）、NaHCO3 粉、1000ml 無菌玻璃瓶（100ml×10 個玻璃瓶）、青霉素、鏈霉素、2~3 個過濾器、注射器。紫外線照臺 30min。2、將培養(yǎng)粉用 900ml 新鮮三蒸水（或新鮮反滲水）溶解，并沖洗袋內殘留粉末。3、充分攪拌，按說明添加成分（如 Invitrogen 公司的 RPMI-1640 配制 1000ml 需加 NaHCO3 粉2。0g，In

3、vitrogen 公司的 DMEM 需加 NaHCO3 粉 3。7g 等），再充分攪拌.無需加谷氨酰胺，因該培養(yǎng)基里已含有。4、用 1M（1mol/L）HCl 調 PH 至 7。0 左右（細胞適宜在 PH7.2~7。4 生長,配制好后 PH 值會升高 0.2~0.3，故配時調 PH 至 7。0 左右）。5、用新鮮三蒸水（或新鮮反滲水）定容到 1000ml。6、配青霉素 80 萬/瓶 + 4ml 蒸餾水 溶解 配鏈霉素 10

4、0 萬/瓶 + 4ml 蒸餾水 溶解 取 0.5ml 青霉素和 0.4ml 鏈霉素加入到 1000ml 培養(yǎng)液中,使其終濃度均為 100U/ml，充分攪拌混勻。7、在無菌操作臺里用 0.22um 的除菌濾膜過濾配制好的培養(yǎng)液，并分裝到到 100ml 玻璃瓶中，玻璃瓶口用薄膜封口，蓋上橡皮塞，放—20℃保存?zhèn)溆?。注意?注意：(1）配制培養(yǎng)液及調節(jié)培養(yǎng)液 PH 值所使用的 HCl 和（或)NaOH 均需新鮮三蒸水（或新鮮反滲水

5、）配制。一般于配制當天制備，以保證水的純度和質量。（2）準備的 準備的 100ml×10 個玻璃瓶必須事先高壓滅菌 個玻璃瓶必須事先高壓滅菌！燒杯、量筒、玻棒、盛新鮮三蒸水（或新鮮反滲水）的容器均不需高壓滅菌，干凈即可。3。1.2 PBS(平衡鹽溶液 平衡鹽溶液)的配制 的配制NaCl 8gKCl 0。2g ＋新鮮三蒸水（或新鮮反滲水）至 1000mlNa2HPO4*H2O 1.56gKH2PO4

6、0。2g（1） 無需調 PH 值，其成分溶解后 PH 為 7。4，不需除菌濾膜過濾除菌，放于 4℃保存，用前直接高壓滅菌（高壓時，裝 PBS 的瓶子的瓶蓋要插針頭!） （2) Na2HPO4*H2O 1.56g 則 Na2HPO4*12 H2O 需 3.4888g（3） 如欲配制 500ml,以上成分減半即可3.1。3 0。25％胰蛋白酶的配制 ％胰蛋白酶的配制胰蛋白酶粉 2。5gEDTA（乙二胺四乙酸二鈉） 0.3

7、gb. PBS 和培養(yǎng)基都可以沖洗培養(yǎng)瓶里細胞中的雜質，但需用溫過的 PBS 沖洗細胞中的雜質。PBS 雖然沖洗雜質效果較好，但它有使細胞易脫壁的傾向，故不可經(jīng)常沖洗細胞。c．不溫的 PBS 用來做難消化細胞消化前沖洗一遍的準備，使細胞加入胰酶后易消化。d．消化后暫時不養(yǎng)細胞的培養(yǎng)瓶，可以往其中加入 2～3ml PBS（防止培養(yǎng)瓶干燥)，培養(yǎng)瓶放CO2 培養(yǎng)箱里短時間保存。下次用該培養(yǎng)瓶再養(yǎng)同種細胞時，把 PBS 吸出棄去，再用培養(yǎng)基沖

8、洗一遍即可再用。（7）DMSO（二甲基亞砜）在常溫下對細胞毒性較大,而在 4℃時，其毒性大大減弱，故凍存的細胞復蘇后應及時洗滌冷凍保護劑 DMSO（離心后棄去上清），防止 DMSO 在常溫下對細胞產(chǎn)生較大毒性！3。3 細胞換液 細胞換液1、倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀態(tài):a.移動細胞培養(yǎng)瓶時,觀察到呈漂浮狀態(tài)的細胞為死細胞；b。生長狀態(tài)良好的細胞：透明度大、折光性強、輪廓不清;能看清部分細胞細微結構,細胞處于對數(shù)生長期時可以見到很多分裂

9、期細胞.c。生長狀態(tài)不良的細胞： 細胞折光性變弱，輪廓增強，胞質中常出現(xiàn)空泡、脂滴、顆粒樣物質，細胞間空隙加大，細胞變得不規(guī)則,失去原有特點。d.只有生長狀態(tài)良好的細胞才適合進一步傳代和實驗。2、紫外線照臺 30min，準備好吸管、試管飯盒，溫育培養(yǎng)基,FBS(胎牛血清）可不溫。實驗開始時打開照明燈和抽風機，用 75％酒精噴雙手.酒精燈點燃放中間。滴管放滴管架上,從左到右順序為:吸細胞液的滴管、吸培養(yǎng)基的滴管、吸 FBS（胎牛血清）的滴

10、管。從水浴箱中取出培養(yǎng)基，擦干水放入操作臺的左邊.3、從 CO2 培養(yǎng)箱中取出細胞培養(yǎng)瓶，在酒精燈外焰上旋轉灼燒其瓶口、蓋子處(注意不要把膠蓋燒焦)，滴管（前端 90％部位）灼燒。細胞培養(yǎng)瓶傾斜,用吸細胞液的滴管吸出舊液棄到廢液碗中，盡量吸干凈。注意：滴管的膠頭應在瓶外壓緊再伸進培養(yǎng)瓶內，避免產(chǎn)生氣泡,且不要伸入瓶內太多，防止造成污染；滴管尖端懸空棄液,不要觸到廢液碗(要親眼看到棄液,防止滴管尖端觸到廢液碗）！4、用吸培養(yǎng)基的滴管吸取培

11、養(yǎng)基 90 滴加入到培養(yǎng)瓶（25c㎡)中，再用吸 FBS（胎牛血清)的滴管吸取 FBS 10 滴加入到培養(yǎng)瓶中。（使 FBS 濃度為 10％）5、旋緊細胞培養(yǎng)瓶蓋后,再旋回半圈，以利于空氣流通。平放回 CO2 培養(yǎng)箱中。6、收拾所用物品、用 75％酒精噴灑操作臺，擦臺，保持臺面整潔。注意 注意:（1）在打開培養(yǎng)基、FBS(胎牛血清）、培養(yǎng)瓶前后均需旋轉灼燒其瓶口和瓶蓋，嚴格注意無菌操作.滅菌飯盒只能在無菌操作臺里打開。（2）鑷子每次使用

12、前均需灼燒。裝 FBS 的瓶子瓶蓋小，用鑷子夾住蓋子灼燒后,再用其夾住瓶蓋蓋上;取其瓶蓋時也是用鑷子夾住瓶蓋取下蓋子.（3）滴管在第一次使用前也需灼燒。注意:除吸取細胞液的滴管外，其他滴管滴加液體時都要懸空滴加.已吸過液體的滴管在再次使用前決不能再灼燒！滴管千萬不能混用！ 已吸過液體的滴管在再次使用前決不能再灼燒！滴管千萬不能混用?。?）培養(yǎng)瓶口不要對著自己，不加試劑時要平放。（5）培養(yǎng)液以沒過細胞為宜。（6）細胞液顏色變黃，死細胞多時