1、【細胞培養(yǎng)】一、細胞的復蘇：非原代培養(yǎng)的細胞一般凍存于液氮之中，需要培養(yǎng)時要先從液氮中取出使之復蘇。細胞復蘇的原則——快速融化：必須將凍存在－196℃液氮中的細胞快速融化至37℃，使細胞外凍存時的冰晶迅速融化，避免冰晶緩慢融化時進入細胞形成再結晶，對細胞造成損害。具體操作如下：1、實驗前準備：1.1、將水浴鍋預熱至37℃，并將含10%FBS的培養(yǎng)液置于其中預熱；。1.2、用75％酒精擦拭紫外線照射30min的超凈工作臺臺面。1.3、在超

2、凈工作臺中按次序擺放好消過毒的離心管、吸管、培養(yǎng)瓶等等。2、取出凍存管及迅速解凍：2.1、根據(jù)細胞凍存記錄按標簽找到所需細胞的編號。2.2、從液氮罐中取出細胞盒，取出所需的細胞，同時核對管外的編號。2.3、迅速將凍存管投入到已經(jīng)預熱的水浴鍋中迅速解凍，并要不斷的搖動，使管中的液體迅速融化，約12min后凍存管內(nèi)液體完全溶解，取出用酒精棉球擦拭凍存管的外壁，再拿入超凈臺內(nèi)。3、平衡離心將細胞懸液吸到離心管中，1000～1500rpm離心3

3、分鐘；4、制備細胞懸液吸去上清液，加入10ml培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打均勻，使細胞懸浮；5、細胞計數(shù)細胞濃度以5105ml為宜。6、培養(yǎng)細胞將復合細胞計數(shù)要求的細胞懸液吸到培養(yǎng)瓶中，將培養(yǎng)瓶放入37℃和5％CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)（略微擰松培養(yǎng)瓶蓋），換液的時間由細胞情況而定。通常，除少數(shù)特別注明對DMSO敏感的細胞外，絕大部分細胞株（包括懸浮性細胞），在解凍之后，可直接放入含有1015ml（5－10倍）新鮮培養(yǎng)基的培養(yǎng)角瓶中，待隔天再置換新

4、鮮培養(yǎng)基以去除DMSO即可，如此可避免大部分解凍后細胞無法生長或貼附的問題。二、細胞的傳代：培養(yǎng)的細胞生長至一定密度之后，由于培養(yǎng)液中營養(yǎng)逐漸消耗、代謝物逐步積累（可見到培養(yǎng)液變黃），而且細胞的生長空間也受到限制，就會影響到細胞的繼續(xù)生存。這時就需要分離出一部分細胞和更新培養(yǎng)液，這一過程就叫做傳代。1、貼壁細胞的傳代具體操作如下：1.1、傳代前準備：1.1.1、預熱培養(yǎng)用液：把裝有培養(yǎng)液、PBS和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴鍋內(nèi)預熱。1

5、.1.2、用75％酒精擦拭雙手和經(jīng)過紫外線照射的超凈工作臺1.1.3、正確擺放使用的器械：保證足夠的操作空間，不僅便于操作而且可減少污染。1.1.4、點燃酒精燈：注意火焰不能太小。1.1.5、準備好將要使用的已滅菌的空培養(yǎng)瓶。1.1.6、取出已經(jīng)預熱好的培養(yǎng)用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超凈臺內(nèi)。1.1.7、從培養(yǎng)箱內(nèi)取出細胞，注意取出細胞時要旋緊瓶蓋，用酒精棉球擦拭顯微鏡的臺面，再在鏡下觀察細胞，并做好記錄。分子結構，以至于降低冷凍

6、保護效果。在常溫下，DMSO對人體有害，故在配制時最好戴上手套操作。2.2、不宜將凍存細胞放置在0℃～60℃這一溫度范圍內(nèi)過久，低溫損傷主要發(fā)生在這一溫度區(qū)內(nèi)，是“危險溫區(qū)”。2.3、注意定期檢查液氮罐內(nèi)液氮量，及時添加。2.4、細胞在液氮中貯存的時間理論上是無限的。但為妥善起見，特別是很多未被凍存過的細胞在首次凍存后要在短期內(nèi)復蘇一次，觀察細胞對凍存的適應性。已建系的細胞最好也每年取一支復蘇一次后，再繼續(xù)凍存。四、細胞計數(shù)實驗原理：當

7、待測細胞懸液中細胞均勻分布時，通過測定一定體積懸液中的細胞的數(shù)目，即可換算出每毫升細胞懸液中細胞的細胞數(shù)目。具體操作如下：1、準備工作：取一瓶傳代的細胞，按上述二的傳代方法繁殖細胞，待長成單層后以使用。2、細胞懸液制備：細胞懸液的制備方法：用0.25％的胰蛋白酶液消化、PBS液洗滌后，加入培養(yǎng)液（或Hanks液或PBS等平衡鹽溶液），吹打制成待測單細胞懸液。3、細胞計數(shù)：2.1、蓋好蓋玻片：取一套血球計數(shù)板，將特制的蓋玻片蓋在血球計數(shù)槽

8、上。2.2、制備計數(shù)用的細胞懸液：用吸管吸適量細胞懸液（如5滴）到一離心管中，加入等體積臺盼藍染液（0.4％）或苯胺黑，活細胞不會被染色，加入染液后就可以在顯微鏡下區(qū)別活細胞和死細胞。若僅是單純的進行細胞計數(shù)，不考慮細胞的活力，則可省略臺盼藍染色步驟。2.3、、將細胞懸液滴入計數(shù)板：將待測細胞懸液吹均勻，然后吸取少量懸液沿蓋片邊緣緩緩滴入，要保證蓋片下充滿懸液，注意蓋片下不要有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中。2.4、統(tǒng)計四個大格的細胞數(shù)

9、：將血球計數(shù)板放于顯微鏡的低倍鏡下觀察，并移動計數(shù)板，當看到鏡中出現(xiàn)計數(shù)方格后，數(shù)出四角的四個大格（每個大格含有16個中鉻）中沒有被染液染上色的細胞數(shù)目。2.5、計算原細胞懸液的細胞數(shù):按照下面公式計算細胞密度：（細胞懸液的細胞數(shù)）ml＝（四個大格子細胞數(shù)4)2104說明：公式中除以4因為計數(shù)了4個大格的細胞數(shù)。公式中乘以2因為細胞懸液于染液是1：1稀釋。公式中乘以104因為計數(shù)板中每一個大格的體積為：1.0mm（長）1.0mm（寬）0