1、細(xì)胞原代培養(yǎng),一、組織塊培養(yǎng)法,實(shí)驗(yàn)?zāi)康?原代培養(yǎng)方法之一：組織塊法,設(shè)備與器材,設(shè)備器械試劑材料,超凈工作臺(tái),設(shè)備與器材,設(shè)備器械試劑材料,,培養(yǎng)箱,CO2,設(shè)備與器材,設(shè)備器械試劑材料,倒置顯微鏡,設(shè)備與器材,設(shè)備器械試劑材料,水浴鍋,設(shè)備與器材,設(shè)備器械試劑材料,解剖器材,設(shè)備與器材,設(shè)備器械試劑材料,玻璃器皿,設(shè)備與器材,設(shè)備器械試劑材料,其它器材,設(shè)備與器材,設(shè)備器械試劑材料,液

2、與培養(yǎng)液,PBS,設(shè)備與器材,設(shè)備器械試劑材料,小牛血清,設(shè)備與器材,設(shè)備器械試劑材料,懷孕大白鼠,培養(yǎng)要點(diǎn),一）材料新鮮二）嚴(yán)格無(wú)菌操作三）剔除脂肪等附著組織四）組織塊剪小（直徑5mm）,操作演示,處死解剖沖洗剪碎培養(yǎng)觀察,擊頭致死,操作演示,處死解剖沖洗剪碎培養(yǎng)觀察,酒精浸泡,操作演示,處死解剖沖洗剪碎培養(yǎng)觀察,送入無(wú)菌室,操作演示,處死解剖沖洗剪碎培養(yǎng)觀察,再次消毒,操作演

3、示,處死解剖沖洗剪碎培養(yǎng)觀察,剪開(kāi)皮膚、腹肌、腹膜,操作演示,處死解剖沖洗剪碎培養(yǎng)觀察,取出胎鼠,操作演示,處死解剖沖洗剪碎培養(yǎng)觀察,挑開(kāi)胎鼠腹腔取出肝組織,操作演示,處死解剖沖洗剪碎培養(yǎng)觀察,PBS液沖洗（4~5次）,操作演示,處死解剖沖洗剪碎培養(yǎng)觀察,剔除其它組織,操作演示,處死解剖沖洗剪碎培養(yǎng)觀察,PBS液再次沖洗,操作演示,處死解剖沖洗剪碎培養(yǎng)觀察,剪碎肝組織

4、,操作演示,處死解剖沖洗剪碎培養(yǎng)觀察,將組織移入培養(yǎng)瓶,操作演示,處死解剖沖洗剪碎培養(yǎng)觀察,加入培養(yǎng)液37°C培養(yǎng),操作演示,處死解剖沖洗剪碎培養(yǎng)觀察,一天后倒置顯微鏡觀察,初學(xué)者易犯的錯(cuò)誤,操作中不更換器械沖洗次數(shù)不夠組織碎片太大組織塊擺放太密培養(yǎng)液加入太多,初學(xué)者易犯的錯(cuò)誤,操作中不更換器械沖洗次數(shù)不夠組織碎片太大組織塊擺放太密培養(yǎng)液加入太多,初學(xué)者易犯的錯(cuò)誤,操作中不更換器械

5、沖洗次數(shù)不夠組織碎片太大組織塊擺放太密培養(yǎng)液加入太多,初學(xué)者易犯的錯(cuò)誤,操作中不更換器械沖洗次數(shù)不夠組織碎片太大組織塊擺放太密培養(yǎng)液加入太多,初學(xué)者易犯的錯(cuò)誤,操作中不更換器械沖洗次數(shù)不夠組織碎片太大組織塊擺放太密培養(yǎng)液加入太多,二、消化培養(yǎng)法,實(shí)驗(yàn)?zāi)康?掌握消化法培養(yǎng)原代細(xì)胞的步驟,設(shè)備與器材,設(shè)備、器械、試劑、材料都與原代培養(yǎng)基本相同。新需試劑有……,胰蛋白酶液,設(shè)備與器材,血球計(jì)數(shù)板、器,培養(yǎng)要點(diǎn),肝組織

6、剪碎至1mm³左右。合適的胰蛋白酶濃度（通常為0.25%）合適的消化時(shí)間：消化時(shí)，待組織塊變得較疏松，顏色暗白為止（通常為37°C 20~40分鐘之間）,實(shí)驗(yàn)材料，前期步驟同細(xì)胞原代培養(yǎng)。將剪碎的鼠肝臟組織進(jìn)行消化……,操作演示,加胰蛋白酶液消化,準(zhǔn)備取材剪碎沖洗消化過(guò)濾離心加培養(yǎng)液計(jì)數(shù)分裝培養(yǎng)觀察,操作演示,37°C水浴鍋內(nèi)消化,準(zhǔn)備取材剪碎沖洗消化過(guò)濾離心加培養(yǎng)液

7、計(jì)數(shù)分裝培養(yǎng)觀察,操作演示,過(guò)濾,準(zhǔn)備取材剪碎沖洗消化過(guò)濾離心加培養(yǎng)液計(jì)數(shù)分裝培養(yǎng)觀察,操作演示,平衡、離心,準(zhǔn)備取材剪碎沖洗消化過(guò)濾離心加培養(yǎng)液計(jì)數(shù)分裝培養(yǎng)觀察,操作演示,棄胰蛋白酶液，加入培養(yǎng)液,準(zhǔn)備取材剪碎沖洗消化過(guò)濾離心加培養(yǎng)液計(jì)數(shù)分裝培養(yǎng)觀察,操作演示,細(xì)胞濃度以5x10 為宜。,準(zhǔn)備取材剪碎沖洗消化過(guò)濾離心加培養(yǎng)液計(jì)數(shù)分裝培養(yǎng)觀察,5,操作演示,

8、分裝,準(zhǔn)備取材剪碎沖洗消化過(guò)濾離心加培養(yǎng)液計(jì)數(shù)分裝培養(yǎng)觀察,操作演示,培養(yǎng),準(zhǔn)備取材剪碎沖洗消化過(guò)濾離心加培養(yǎng)液計(jì)數(shù)分裝培養(yǎng)觀察,操作演示,24小時(shí)后倒置顯微鏡下觀察,準(zhǔn)備取材剪碎沖洗消化過(guò)濾離心加培養(yǎng)液計(jì)數(shù)分裝培養(yǎng)觀察,初學(xué)者易犯的錯(cuò)誤,水浴鍋未預(yù)熱組織塊太大胰蛋白酶消化 不足或過(guò)度吹打用力過(guò)度,初學(xué)者易犯的錯(cuò)誤,水浴鍋未預(yù)熱組織塊太大胰蛋白酶消化

9、 不足或過(guò)度吹打用力過(guò)度,初學(xué)者易犯的錯(cuò)誤,水浴鍋未預(yù)熱組織塊太大胰蛋白酶消化 不足或過(guò)度吹打用力過(guò)度,初學(xué)者易犯的錯(cuò)誤,水浴鍋未預(yù)熱組織塊太大胰蛋白酶消化 不足或過(guò)度吹打用力過(guò)度,細(xì)胞傳代培養(yǎng),實(shí)驗(yàn)?zāi)康?細(xì)胞在原培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)分離稀釋后傳到新培養(yǎng)瓶的操作叫傳代。要獲得穩(wěn)定的細(xì)胞株或得到大量同種細(xì)胞，當(dāng)培養(yǎng)細(xì)胞形成致密的單層后需要進(jìn)行傳代培養(yǎng)。,實(shí)驗(yàn)材料,培養(yǎng)瓶里已長(zhǎng)成單層

10、的細(xì)胞,演示操作,傳代前準(zhǔn)備,1.預(yù)熱培養(yǎng)用液,2.用75%酒精擦拭雙手和工作臺(tái)面,3.擺放使用器械,4.點(diǎn)燃酒精燈,5.取出已預(yù)熱的培養(yǎng)用液,6.從培養(yǎng)箱中取出細(xì)胞,7.各種器皿火焰消毒,演示操作,傳代前準(zhǔn)備胰蛋白酶消化,1.加入消化液,2.顯微鏡下觀察細(xì)胞,3.吸棄消化液，加入培養(yǎng)液,演示操作,傳代前準(zhǔn)備胰蛋白酶消化吹打分散細(xì)胞,1.吹打制懸,2.吸細(xì)胞懸液入離心管,3.平衡離心,4. 棄上清液，加入新培養(yǎng)液,演示操作,傳代前

11、準(zhǔn)備胰蛋白酶消化吹打分散細(xì)胞分裝稀釋細(xì)胞,1.分裝,2.顯微鏡下觀察細(xì)胞,演示操作,傳代前準(zhǔn)備胰蛋白酶消化吹打分散細(xì)胞分裝稀釋細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng),用酒精棉球擦拭培養(yǎng)瓶，旋松瓶口，放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。,注意事項(xiàng),嚴(yán)格無(wú)菌操作,污染細(xì)胞,未污染細(xì)胞,瓶口碰到酒精燈 X,手在瓶口上方移動(dòng) X,注意事項(xiàng),嚴(yán)格無(wú)菌操作適度消化,未消化細(xì)胞,細(xì)胞消化過(guò)程,細(xì)胞計(jì)數(shù),實(shí)驗(yàn)?zāi)康?學(xué)習(xí)并掌握培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)目的測(cè)定方法學(xué)會(huì)使用血球計(jì)數(shù)板,設(shè)備與

12、器材,設(shè)備、器械、試劑、材料都與傳代培養(yǎng)基本相同。新需試劑有……,設(shè)備與器材,光學(xué)顯微鏡,設(shè)備與器材,臺(tái)盼藍(lán),0.4%,實(shí)驗(yàn)原理,當(dāng)待測(cè)細(xì)胞懸液中細(xì)胞均勻分布時(shí)，通過(guò)測(cè)定一定體積懸液中細(xì)胞的數(shù)目，即可換算出每毫升懸液中的細(xì)胞數(shù)目。,操作演示,準(zhǔn)備工作,取一瓶傳代的細(xì)胞，按《傳代細(xì)胞培養(yǎng)方法（消化法）》介紹的方法繁殖細(xì)胞，待長(zhǎng)成單層后以備使用。,操作演示,準(zhǔn)備工作細(xì)胞懸液的制備,用0.25%的胰蛋白酶液消化、PBS液洗滌后，加入培養(yǎng)液

13、（或Hanks液，PBS等平衡溶液），吹打制成待測(cè)細(xì)胞懸液。,操作演示,準(zhǔn)備工作細(xì)胞懸液的制備細(xì)胞計(jì)數(shù),蓋好蓋玻片,制備計(jì)數(shù)用的細(xì)胞懸液,將細(xì)胞懸液滴入計(jì)數(shù)板,統(tǒng)計(jì)四個(gè)大格的細(xì)胞數(shù),,計(jì)算細(xì)胞懸液細(xì)胞數(shù),操作演示,準(zhǔn)備工作細(xì)胞懸液的制備細(xì)胞計(jì)數(shù)細(xì)胞計(jì)數(shù)要點(diǎn),初學(xué)者易犯的錯(cuò)誤,未將懸液吹打均勻X,初學(xué)者易犯的錯(cuò)誤,未將懸液吹打均勻X蓋玻片下有氣泡X,初學(xué)者易犯的錯(cuò)誤,未將懸液吹打均勻X蓋玻片下有氣泡X細(xì)胞懸液流入槽中X,細(xì)

14、胞凍存,實(shí)驗(yàn)?zāi)康?學(xué)習(xí)掌握細(xì)胞凍存技術(shù)了解培養(yǎng)細(xì)胞的運(yùn)輸方法,設(shè)備、器械和試劑,設(shè)備、器械、試劑、材料都與原代培養(yǎng)基本相同。新需器材、試劑有……,液氮罐,-20°C冰箱,-80°C冰箱,凍存細(xì)胞登記本,手套、凍存管等,甘油、二甲亞砜,實(shí)驗(yàn)原理,細(xì)胞培養(yǎng)的需要,實(shí)驗(yàn)原理,細(xì)胞培養(yǎng)的需要直接冷凍的危害,冰晶形成,實(shí)驗(yàn)原理,細(xì)胞培養(yǎng)的需要直接冷凍的危害細(xì)胞凍存的原則,加保護(hù)劑：甘油或二甲亞砜（DMSO）可使細(xì)胞內(nèi)

15、冰點(diǎn)下降：膜透性增加。緩慢冷凍：細(xì)胞內(nèi)水份逐步均勻的減少，避免冰晶大量形成。,凍存方案,標(biāo)準(zhǔn)方案,室溫 ~ -25°C ： 降溫速率是1~2°C/min；~25 ~ -100°C： 降溫速率是5~10°C/min；-100°C以下：

16、 直接放入液氮中。,標(biāo)準(zhǔn)凍存方案,凍存方案,標(biāo)準(zhǔn)方案簡(jiǎn)易凍存方案,簡(jiǎn)易凍存方案,凍存管用厚棉花分隔，放入盒子中；置于-20°C冰箱內(nèi)2小時(shí)；立即轉(zhuǎn)入-80°C冰箱內(nèi)4小時(shí)；再迅速置入-196°C液氮內(nèi)長(zhǎng)期保存。,操作演示,細(xì)胞凍存,細(xì)胞凍存,一、篩選細(xì)胞,1、觀察細(xì)胞,2、做標(biāo)記,3、換培養(yǎng)液,細(xì)胞凍存,一、篩選細(xì)胞二、細(xì)胞消化（第二天）,細(xì)胞消化方法同傳代培養(yǎng)細(xì)胞消化。,細(xì)胞凍存,一、篩

17、選細(xì)胞二、細(xì)胞消化（第二天）三、細(xì)胞離心,細(xì)胞離心按傳代培養(yǎng)離心標(biāo)準(zhǔn)，收集細(xì)胞。,細(xì)胞凍存,一、篩選細(xì)胞二、細(xì)胞消化（第二天）三、細(xì)胞離心四、細(xì)胞計(jì)數(shù),細(xì)胞計(jì)數(shù),細(xì)胞凍存,一、篩選細(xì)胞二、細(xì)胞消化（第二天）三、細(xì)胞離心四、細(xì)胞計(jì)數(shù)五、分裝細(xì)胞,1、棄去上清液,2、加入凍存液,3、裝入凍存管,4、用棉花包裝,細(xì)胞凍存,一、篩選細(xì)胞二、細(xì)胞消化（第二天）三、細(xì)胞離心四、細(xì)胞計(jì)數(shù)五、分裝細(xì)胞六、簡(jiǎn)易凍存,1、-

18、20°C冰箱預(yù)凍,2、-80°C冰箱預(yù)凍,3、作好標(biāo)簽,4、液氮罐中凍存,5、登記入冊(cè),凍存注意事項(xiàng),細(xì)胞復(fù)蘇,實(shí)驗(yàn)?zāi)康?掌握細(xì)胞復(fù)蘇的方法,設(shè)備、器械和試劑,同上述細(xì)胞凍存……,實(shí)驗(yàn)原則,操作演示,一、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備,查找電腦上細(xì)胞記錄,凍存本上查找細(xì)胞,水浴鍋37°C預(yù)熱,操作演示,一、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備二、取出凍存管,尋找標(biāo)簽,取出凍存管,操作演示,一、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備二、取出凍存管三、迅速解凍,在水浴鍋內(nèi)迅速解

19、凍,酒精棉球擦拭凍存管,操作演示,一、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備二、取出凍存管三、迅速解凍四、平衡離心,平衡離心按傳代培養(yǎng)離心標(biāo)準(zhǔn)，收集細(xì)胞。,操作演示,一、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備二、取出凍存管三、迅速解凍四、平衡離心五、制備細(xì)胞懸液,吸出上清液,加入培養(yǎng)液吹打制懸,操作演示,一、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備二、取出凍存管三、迅速解凍四、平衡離心五、制備細(xì)胞懸液六、細(xì)胞計(jì)數(shù),細(xì)胞計(jì)數(shù)詳細(xì)方法參考細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞稀釋濃度 5 x 10 /ml,5,操