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![基于聚乙烯亞胺包裹的納米金顆粒對PCR的優(yōu)化研究及其在基因傳遞中的研究.pdf_第1頁](https://static.zsdocx.com/FlexPaper/FileRoot/2019-3/6/23/873d63a8-abd2-47b0-a762-3f897d33306f/873d63a8-abd2-47b0-a762-3f897d33306f1.gif)
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文檔簡介
1、隨著納米科技的快速發(fā)展,采用納米技術(shù)制備的納米材料成為了當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。納米材料由于具有特殊的物理化學(xué)性質(zhì),已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域,并取得了很多有價(jià)值的應(yīng)用成果。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction,PCR技術(shù))是一種基于DNA擴(kuò)增的分子生物學(xué)技術(shù),也是臨床醫(yī)學(xué)中的檢測疾病的重要手段,但是PCR擴(kuò)增中時常出現(xiàn)的低效率和非特異性問題限制了該技術(shù)的廣泛應(yīng)用?!凹{米PCR”概念的引進(jìn)為PCR技術(shù)的完善提供了
2、一種獨(dú)特的思路。此外,基因治療(Gene therapy)作為一種新型的治療疾病的方法被認(rèn)為是藥學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一次革命。與傳統(tǒng)治療方法相比,基因治療有望從根本上治療疾病,已成為目前國際學(xué)術(shù)界研究的焦點(diǎn)。然而,基因傳遞中使用的基因傳遞載體經(jīng)常具有很高的毒性或者較低的轉(zhuǎn)染效率,以納米材料為代表的非病毒載體逐漸成為科學(xué)家們研究的“新寵”。
本碩士論文主要是以超支化聚乙烯亞胺(Polyethylenimine,PEI)包裹的納米金顆粒
3、作為優(yōu)化劑應(yīng)用于PCR技術(shù),并探討其優(yōu)化機(jī)理,同時作為一種負(fù)載外源正?;虻膫鬟f載體應(yīng)用于基因治療的研究。我們希望通過本論文的研究,開發(fā)出一種既可以優(yōu)化 PCR技術(shù)又能作為理想的基因傳遞載體的多功能性的納米材料。
在第二章中,首先我們通過選擇價(jià)廉易得的PEI作為樹狀大分子的替代品,在PEI表面修飾聚乙二醇(mPEG),用來提高納米材料的穩(wěn)定性和生物相容性。并以此為模板,利用硼氫化鈉還原法,調(diào)控氯金酸與PEI的投料摩爾比,從而調(diào)
4、控納米材料的結(jié)構(gòu),表面電勢和粒徑大小,最終合成了一系列包裹不同數(shù)量納米金顆粒的 PEGAu PENPs(PEGylated PEI-entrapped Entrapped Gold Nanoparticles)。另外,通過表征數(shù)據(jù)可知:所合成的PEGAu PENPs粒徑較小、分布均勻、具有良好的生物相容性和較高的熱導(dǎo)率。
在第三章中,根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn),我們首先建立了兩種 PCR擴(kuò)增體系:二輪易錯PCR反應(yīng)體系和高GC含量(74%G
5、C含量)PCR反應(yīng)體系。然后以這兩種體系作為 PCR優(yōu)化劑的篩選平臺,通過一系列優(yōu)化實(shí)驗(yàn)和凝膠電泳實(shí)驗(yàn)來評估PEGAu PENPs的優(yōu)化能力。此外,我們通過系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),進(jìn)一步探討了納米材料對 PCR技術(shù)的優(yōu)化機(jī)理。結(jié)果表明:所有的PEGAu PENPs都可以提高PCR反應(yīng)的效率和特異性。值得指出的是,我們發(fā)現(xiàn)納米材料在不同的 PCR體系中,可能展示著不同的優(yōu)化機(jī)理。在二輪易錯PCR體系中,PEGAu PENPs的優(yōu)化作用可能是由于其
6、表面電荷介導(dǎo)的靜電作用所導(dǎo)致的;而在高GC含量PCR體系中,PEGAu PENPs的良好的熱傳遞性能可能是優(yōu)化PCR反應(yīng)的主要原因。
在第四章中,我們首先通過凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)測試了PEGAu PENPs壓縮pDNA的能力,然后通過增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)基因和熒光素酶(Luc)基因的表達(dá)實(shí)驗(yàn)來衡量材料的轉(zhuǎn)染效率。最后,通過流式細(xì)胞術(shù)以及材料/pDNA復(fù)合物在細(xì)胞內(nèi)的定位實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究了材料的轉(zhuǎn)染機(jī)理。結(jié)合第二章的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)
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