1、肺癌是惡性腫瘤中導(dǎo)致死亡的主要原因之一，盡管近年來肺癌的治療已經(jīng)取得了較大的進(jìn)步，但是由于表觀遺傳等復(fù)雜因素在腫瘤的生長和侵襲中起著重要的作用，患者長期生存率仍舊不高。因此，發(fā)現(xiàn)新的癌基因/抑癌基因并闡明其作用機(jī)制是防治腫瘤的重要任務(wù)。近年來Hippo信號(hào)通路與腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展的關(guān)系備受重視。Hippo信號(hào)通路的作用在于通過控制蛋白分布和蛋白水平來調(diào)控YAP/TAZ的功能。因此，YAP轉(zhuǎn)位入核是該通路失活的核心過程。Ras相關(guān)結(jié)構(gòu)域家族

2、(Ras-association domain family，RASSF)由十名成員組成，即經(jīng)典的RASSF1-6和N-端的RASSF7-10。前者均含C-端SARAH結(jié)構(gòu)域（Sav/RASSF/Hippo）和中間的RA結(jié)構(gòu)域，后者只有N-末端的RA結(jié)構(gòu)域，并且在其C-末端并不存在SARAH結(jié)構(gòu)域。只是最近才有人預(yù)測，在RASSF7，RASSF8和RASSF10的C-末端中可能存在另一種卷曲雙螺旋結(jié)構(gòu)(Coiled-coil domai

3、n)，而且預(yù)測它可能具備SARAH結(jié)構(gòu)域的功能。最近的研究表明:經(jīng)典的Ras相關(guān)結(jié)構(gòu)域家族與Hippo通路密切相關(guān)。RA結(jié)構(gòu)域位于N-末端并缺少SARAH結(jié)構(gòu)域的非經(jīng)典的RASSF7的生物學(xué)作用和機(jī)制是否也同Hippo通路有關(guān)？這引起了我們的極大興趣。
　　目的:
　　本研究中，我們通過檢測RASSF7在非小細(xì)胞肺癌組織和肺癌細(xì)胞中的表達(dá)及與臨床病理因素、預(yù)后之間的關(guān)系，并通過體內(nèi)體外兩種實(shí)驗(yàn)觀察了RASSF7的生物學(xué)功能，

4、通過構(gòu)建和轉(zhuǎn)染RASSF7、RASSF7-△-RA和RASSF7-△-CC等多種RASSF7的突變體，旨在闡明RASSF7在非小細(xì)胞肺癌中發(fā)揮作用的可能機(jī)制。
　　方法:
　　收集88例中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院行手術(shù)治療切除并具有完整隨訪資料的非小細(xì)胞肺癌患者的癌組織及20例癌旁正常組織(距癌組織5cm)石蠟包埋標(biāo)本。另外收集2016年手術(shù)切除的24例新鮮肺癌組織標(biāo)本。免疫組織化學(xué)檢測RASSF7在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)，分析

5、其與臨床病理因素及不良預(yù)后之間的關(guān)系;Western blot和qPCR檢測肺癌組織及肺癌細(xì)胞系中RASSF7表達(dá)情況;分別在RASSF7相對(duì)表達(dá)量高或低的細(xì)胞系中敲除或過表達(dá)RASSF7，通過MTT、克隆形成實(shí)驗(yàn)、基質(zhì)膠侵襲實(shí)驗(yàn)和Western blot探討RASSF7對(duì)肺癌細(xì)胞增殖與侵襲及相關(guān)蛋白的影響;Western blot、熒光素酶報(bào)告基因及qPCR檢測肺癌細(xì)胞中敲除或過表達(dá)RASSF7對(duì)Hippo信號(hào)通路及下游靶基因CTGF

6、和Cyr61mRNA表達(dá)水平的影響;通過構(gòu)建和轉(zhuǎn)染RASSF7、RASSF7-△-RA和RASSF7-△-CC等多種RASSF7的突變體，觀察RASSF7突變體對(duì)肺癌細(xì)胞的影響，并通過皮下和尾靜脈注射到裸鼠體內(nèi)，探討RASSF7發(fā)揮作用的可能機(jī)制。
　　結(jié)果:
　　1、與癌旁正常肺組織中RASSF7低表達(dá)、幾乎為陰性表達(dá)相比，非小細(xì)胞肺癌組織中呈高表達(dá)RASSF7主要定位于胞漿。新鮮配對(duì)肺癌組織中RASSF7蛋白及mRNA的

7、表達(dá)明顯高于其配對(duì)的癌旁組織。RASSF7的胞漿高表達(dá)與肺癌患者高TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移正相關(guān)，RASSF7的胞核高表達(dá)與肺癌患者的各臨床病理因素間無明顯相關(guān)性。生存分析顯示RASSF7總表達(dá)、胞漿高表達(dá)的非小細(xì)胞肺癌患者生存時(shí)間明顯低于RASSF7胞漿陰性表達(dá)的非小細(xì)胞肺癌患者的生存時(shí)間，RASSF7胞核高表達(dá)的患者生存時(shí)間與RASSF7胞核低表達(dá)的患者生存時(shí)間相似。RASSF7胞漿高表達(dá)是非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后獨(dú)立危險(xiǎn)因素。
　

8、　2、在A549和H1299細(xì)胞系中分別轉(zhuǎn)染和干擾，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染RASSF7質(zhì)粒促進(jìn)了細(xì)胞的增殖和侵襲（P＜0.05），提高了RASSF7、cyclinE及MMP2的蛋白表達(dá)水平，降低了P21蛋白表達(dá)水平。而轉(zhuǎn)染RASSF7-ShRNA后抑制了細(xì)胞增殖與侵襲，顯著降低了RASSF7、cyclinE及MMP2的蛋白表達(dá)，升高了P21蛋白表達(dá)水平。
　　3、轉(zhuǎn)染RASSF7質(zhì)粒后可以明顯提高Hippo通路轉(zhuǎn)錄子TEAD的轉(zhuǎn)錄活性、降低核心

9、成員MST1/2、LATS、YAP的磷酸化水平，下游靶基因CTGF蛋白表達(dá)增多，同時(shí)，CTGF和Cyr61的mRNA表達(dá)也明顯升高;反之，敲除RASSF7時(shí)Hippo通路轉(zhuǎn)錄子TEAD的轉(zhuǎn)錄活性、核心成員MST1/2、LATS、YAP的磷酸化水平、游靶基因CTGF蛋白表達(dá)及CTGF和Cyr61的mRNA表達(dá)(P＜0.01)均呈現(xiàn)相反的結(jié)果。我們對(duì)轉(zhuǎn)染RASSF7質(zhì)粒的細(xì)胞進(jìn)行核/漿分離提蛋白，Western blot結(jié)果顯示過表達(dá)RAS

10、SF7后細(xì)胞核中的YAP蛋白表達(dá)明顯增加，敲除RASSF7降低細(xì)胞核內(nèi)YAP蛋白的表達(dá)。免疫熒光也證明了這一點(diǎn)。RASSF7過表達(dá)組同時(shí)敲除YAP時(shí)，上述指標(biāo)表達(dá)均被恢復(fù)。
　　4、我們?cè)谧C實(shí)了RASSF7能與MST1結(jié)合并且觀察到二者存在共定位的基礎(chǔ)上，用RASSF7的4種剪接體轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)只有去除Coiled-coil結(jié)構(gòu)域的R7-Mut4不能與MST1結(jié)合，說明二者正是通過Coiled-coil結(jié)構(gòu)域相結(jié)合來發(fā)揮作

11、用的。為了進(jìn)一步驗(yàn)證上述結(jié)論，我們?cè)贏549細(xì)胞中轉(zhuǎn)染RASSF7及其剪接體質(zhì)粒后，分別檢測了轉(zhuǎn)染RASSF7及其剪接體后Hippo通路核心蛋白、Hippo通路轉(zhuǎn)錄子TEAD的轉(zhuǎn)錄活性、細(xì)胞增殖及侵襲的變化。結(jié)果顯示:與RASSF7及其他三個(gè)剪接體組相比，只有R7-Mut4過表達(dá)組細(xì)胞的MST1、LATS及YAP等核心蛋白的磷酸化水平出現(xiàn)明顯回升;轉(zhuǎn)錄子TEAD的轉(zhuǎn)錄活性顯著降低;細(xì)胞的增殖能力下降;細(xì)胞的遷移、侵襲能力也被抑制。充分說

12、明RASSF7通過Coiled-coil結(jié)構(gòu)域與MST1結(jié)合，從而通過Hippo信號(hào)通路發(fā)揮作用。而RA結(jié)構(gòu)域去除2個(gè)Coiled-coil結(jié)構(gòu)域中的1個(gè)，對(duì)RASSF7的功能影響不大。
　　5、將轉(zhuǎn)染空載體、RASSF7質(zhì)粒、RASSF7-Mut4的細(xì)胞經(jīng)皮下或尾靜脈注射裸鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)與轉(zhuǎn)染空載體組和轉(zhuǎn)染RASSF7-Mut4組相比，轉(zhuǎn)染RASSF7質(zhì)粒組的移植瘤體積和質(zhì)量均有明顯提高，其在肺內(nèi)的轉(zhuǎn)移瘤病灶數(shù)量也明顯增多。免疫組

13、織化學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染RASSF7質(zhì)粒組的Ki-67蛋白的表達(dá)均顯著增加，同時(shí)YAP轉(zhuǎn)位入核增加，;而轉(zhuǎn)染R7-Mut4組無論是移植瘤的體積、質(zhì)量、Ki-67及RASSF7蛋白的表達(dá)，還是肺轉(zhuǎn)移瘤的數(shù)量及YAP核定位均較轉(zhuǎn)染RASSF7質(zhì)粒組有顯著下降，且接近于NC組，進(jìn)一步證明了RASSF7發(fā)揮作用依賴于Coiled-coil結(jié)構(gòu)域。
　　結(jié)論:
　　1、RASSF7在非小細(xì)胞肺癌中高表達(dá)并與預(yù)后相關(guān);
　　2、體內(nèi)外實(shí)