1、目的：他莫昔芬對(duì)ERα陽(yáng)性的乳腺癌患者有良好的治療效果，但是耐藥性的出現(xiàn)限制其效果和應(yīng)用。目前認(rèn)為細(xì)胞自噬可能為導(dǎo)致他莫昔芬耐藥性的關(guān)鍵機(jī)制之一，但此種保護(hù)性自噬形成的具體分子機(jī)制及如何促使他莫昔芬產(chǎn)生耐藥性尚未闡明。藁本內(nèi)酯為當(dāng)歸、川芎中的主要活性成分之一，在目前的研究中，僅有一篇文獻(xiàn)指出藁本內(nèi)酯能調(diào)控TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬，它對(duì)自噬的具體作用并未做探究，且藁本內(nèi)酯能否恢復(fù)耐藥ERα陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞的他莫昔芬敏感性也還未見報(bào)道。本研究

2、擬首先闡明他莫昔芬耐藥性產(chǎn)生過(guò)程中保護(hù)性自噬形成的機(jī)制，并且明確保護(hù)性自噬對(duì)DNA損傷修護(hù)機(jī)制的影響，進(jìn)而揭示他莫昔芬耐藥性產(chǎn)生的機(jī)制。同時(shí)，以藁本內(nèi)酯為研究對(duì)象，對(duì)其抑制自噬及DNA損傷修護(hù)機(jī)制和恢復(fù)耐-他莫昔芬的ERα陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞的敏感性進(jìn)行了初步探索。
　　方法：采用高濃度短時(shí)間他莫昔芬沖擊法誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞的耐藥性。在表征敏感株與耐藥株之間的區(qū)別方面：以磺酰羅丹明B法檢測(cè)他莫昔芬對(duì)敏感株和耐藥株細(xì)胞存活率的影響。再以GFP

3、-LC3觀察敏感株和耐藥株中基礎(chǔ)自噬水平的差別；采用Western blotting檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)輔以驗(yàn)證。隨后加入自噬抑制劑氯喹探討耐藥株中的自噬是否對(duì)其存活有保護(hù)作用。最后用免疫共沉淀的方法探討耐藥株中自噬水平升高的分子機(jī)制。在考察藁本內(nèi)酯對(duì)細(xì)胞自噬的調(diào)控作用及其分子機(jī)制方面：首先RFP-LC3和Western blotting檢測(cè)藁本內(nèi)酯對(duì)細(xì)胞自噬的調(diào)控作用；加入氯喹聯(lián)合處理輔以驗(yàn)證。后以tf-mRFP-GFP-LC3質(zhì)粒、G

4、FP-LC3&RFP-LAMP1質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染、檢測(cè)組織蛋白酶D的表達(dá)和溶酶體的pH等實(shí)驗(yàn)確定藁本內(nèi)酯調(diào)控自噬的機(jī)制。在考察藁本內(nèi)酯恢復(fù)耐藥乳腺癌細(xì)胞的他莫昔芬敏感性方面：首先以磺酰羅丹明B法檢測(cè)藁本內(nèi)酯單獨(dú)或聯(lián)合他莫昔芬對(duì)耐藥乳腺癌細(xì)胞存活率的影響，同時(shí)以克隆形成實(shí)驗(yàn)和Hoechst33342染色輔以驗(yàn)證。再檢測(cè)PARP的表達(dá)以及泛Caspase抑制劑（Z-VAD-FMK）對(duì)細(xì)胞存活率的恢復(fù)作用，考察藁本內(nèi)酯恢復(fù)他莫昔芬細(xì)胞毒性是否通過(guò)

5、Caspase途徑。在考察DNA損傷及藁本內(nèi)酯是否干擾DNA損傷修復(fù)機(jī)制方面：首先考察DNA損傷相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，進(jìn)一步地采用shRNA抑制Nur77的表達(dá)后，考察是否Nur77對(duì)耐藥株DNA損傷水平和細(xì)胞存活率有影響。接下來(lái)加入泛素化抑制劑MG132、siRNA抑制Beclin1、藁本內(nèi)酯、氯喹處理細(xì)胞，通過(guò)Western blotting檢測(cè)Nur77能否被恢復(fù)表達(dá)。最后通過(guò)免疫共沉淀和DNA親和沉淀實(shí)驗(yàn)（DAPA）法探討藁本內(nèi)酯

6、如何通過(guò)Nur77干擾DNA損傷修復(fù)途徑的機(jī)制。
　　結(jié)果：對(duì)比MCF-7和T-47D細(xì)胞，MCF-7TR5和T-47DTR5細(xì)胞對(duì)~5μM的他莫昔芬表現(xiàn)出良好的耐受性。GFP-LC3質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后，比之MCF-7細(xì)胞，MCF-7TR5細(xì)胞中觀察到綠色點(diǎn)狀熒光聚集，自噬標(biāo)記物L(fēng)C3-II/I、p62蛋白的表達(dá)下降，且BRCA1、Nur77等蛋白表達(dá)也降低；而通過(guò)氯喹抑制自噬后能明顯增強(qiáng)他莫昔芬的細(xì)胞毒性；最后，免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果表

7、明Beclin1-PI3KC3-ATG14復(fù)合物結(jié)合增加。mRFP-LC3質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染MCF-7TR5細(xì)胞后，藁本內(nèi)酯能明顯增加細(xì)胞內(nèi)紅色點(diǎn)狀熒光聚集；進(jìn)一步的Western blotting結(jié)果表明藁本內(nèi)酯以時(shí)間-和劑量-依賴性方式增加LC3-II/I和p62的表達(dá)，與氯喹類似。隨后tf-mRFP-GPF-LC3轉(zhuǎn)染MCF-7TR5細(xì)胞后，藁本內(nèi)酯和氯喹誘導(dǎo)MCF-7TR5細(xì)胞中黃色熒光增加；GFP-LC3和RFP-LAMP1共同轉(zhuǎn)染

8、MCF-7TR5細(xì)胞，藁本內(nèi)酯導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)黃色熒光減少，二者均表明自噬-溶酶體融合受阻。進(jìn)一步地實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明藁本內(nèi)酯能下調(diào)組織蛋白酶D的表達(dá)，并中和溶酶體pH。藁本內(nèi)酯聯(lián)合他莫昔芬處理耐藥乳腺癌細(xì)胞后，實(shí)驗(yàn)表明聯(lián)合給藥能夠增加耐藥乳腺癌細(xì)胞的凋亡，降低耐藥乳腺癌細(xì)胞存活率及細(xì)胞集落的形成。然而活化的PARP表達(dá)沒(méi)有變化；與之相符合的是泛Caspase抑制劑Z-VAD-FMK也不能恢復(fù)聯(lián)合給藥下調(diào)的細(xì)胞存活率。對(duì)比MCF-7細(xì)胞，MCF-7

9、TR5細(xì)胞中BRCA1、RAD51表達(dá)下降，表明DNA損傷修復(fù)的同源重組修復(fù)途徑受損，而Ku80表達(dá)上升，則DNA損傷修復(fù)的非同源性末端接合機(jī)制啟動(dòng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明MCF-7TR5細(xì)胞中γ-H2AX的表達(dá)高于MCF-7細(xì)胞；隨后對(duì)比單獨(dú)的他莫昔芬，藁本內(nèi)酯聯(lián)合他莫昔芬能上調(diào)細(xì)胞內(nèi)γ-H2AX的表達(dá)。sh-RNA法抑制細(xì)胞內(nèi)Nur77的表達(dá)后，聯(lián)合給藥導(dǎo)致的γ-H2AX表達(dá)積累和下調(diào)MCF-7TR5細(xì)胞存活率的作用被逆轉(zhuǎn)。隨后，MG132、

10、siRNA抑制Beclin1、氯喹和藁本內(nèi)酯分別處理細(xì)胞后，結(jié)果表明只有抑制自噬能夠恢復(fù)Nur77的表達(dá)。接下來(lái)，免疫共沉淀法證實(shí)在MCF-7TR5細(xì)胞中，Nur77與Ku80的相互作用減弱，但藁本內(nèi)酯能夠增強(qiáng)二者的相互作用；最后DNA親和沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí)藁本內(nèi)酯能夠抑制Ku80和DNA-PKcs分別與DNA-末端的結(jié)合作用。
　　結(jié)論：隨著他莫昔芬的治療，乳腺癌細(xì)胞內(nèi)Beclin1與Bcl2的結(jié)合減弱，釋放出Beclin1，導(dǎo)致Be

11、clin1-PI3KC3-ATG14復(fù)合物結(jié)合增加，自噬水平上升，產(chǎn)生耐藥性促進(jìn)癌細(xì)胞存活。此外，由于BRCA1和RAD51表達(dá)的下降， Ku80表達(dá)的升高，MCF-7TR5細(xì)胞出現(xiàn)更高的DNA損傷水平。有趣的是，耐藥株中過(guò)高的細(xì)胞自噬導(dǎo)致Nur77的表達(dá)降低，使其與Ku80形成的復(fù)合物降低，導(dǎo)致非同源重組修復(fù)水平升高。在細(xì)胞自噬方面，藁本內(nèi)酯通過(guò)干擾自噬體與溶酶體的融合和影響溶酶體功能抑制自噬。更重要的是，藁本內(nèi)酯抑制自噬恢復(fù)MCF-