1、淀粉酶作為目前工業(yè)上最重要的酶制劑之一，約占整個(gè)工業(yè)酶生產(chǎn)的50％。其中，耐高溫α-淀粉酶由于具備高溫條件下水解淀粉的能力，使其在食品、發(fā)酵、紡織、造紙等工業(yè)都具有極高的用途。目前，工業(yè)用的耐高溫α-淀粉酶主要為地衣芽孢桿菌α-淀粉酶(BLA)。然而，使用野生型地衣芽孢桿菌做為生產(chǎn)BLA的發(fā)酵宿主具有產(chǎn)酶量小，雜蛋白多等缺陷，因此需要開(kāi)發(fā)新的工程菌來(lái)作為BLA表達(dá)宿主以滿足其大量的工業(yè)需求。另外，在某些更加極端苛刻的工業(yè)環(huán)境下，野生型B

2、LA已經(jīng)難以滿足其要求。開(kāi)發(fā)耐受更高溫度，適應(yīng)更低pH，且不依賴Ca2+的新型耐高溫α-淀粉酶已成為淀粉酶研究主要方向之一。
　　本研究首先通過(guò)查閱相關(guān)文獻(xiàn)以及專利，確定了兩個(gè)BLA氨基酸突變位點(diǎn)，即將野生型BLA成熟肽第190位的天冬酰胺突變?yōu)楸奖彼?，?64位的谷氨酰胺突變?yōu)榻z氨酸，從而使其具有更高熱穩(wěn)定性以及更低Ca2+依賴性。隨后將突變后的氨基酸序列針對(duì)枯草芽孢桿菌表達(dá)宿主進(jìn)行了密碼子優(yōu)化，合成了突變型地衣芽孢桿菌α-淀

3、粉酶基因amyLM。在枯草芽孢桿菌168菌株中實(shí)現(xiàn)了amyLM的成功表達(dá)，90℃下測(cè)得耐高溫淀粉酶酶活為46U/ml。
　　其次，本研究為進(jìn)一步提高amyLM在枯草芽孢桿菌中發(fā)酵液中的酶活進(jìn)行了優(yōu)化。改用缺少8個(gè)蛋白酶的枯草芽孢桿菌WB800n工程菌作為表達(dá)宿主，并且對(duì)強(qiáng)啟動(dòng)子P43介導(dǎo)amyLM的表達(dá)進(jìn)行分子層面的深入研究。通過(guò)改變amyLM基因與P43啟動(dòng)子SD序列之間的距離，研究了不同距離對(duì)于amyLM表達(dá)量的影響，優(yōu)化了P

4、43的使用方法。結(jié)果表明，當(dāng)使用距離P43啟動(dòng)子的SD序列為9bp的起始密碼子ATG作為amyLM的起始密碼子時(shí)，發(fā)酵液中BLA酶活最高，達(dá)到422U/ml，是未優(yōu)化前的9.17倍。本研究中對(duì)于P43介導(dǎo)amyLM的表達(dá)所進(jìn)行的分子層面的優(yōu)化為后續(xù)使用P43介導(dǎo)其他外源蛋白的表達(dá)提供了思路。
　　最后，本研究還使用麥芽糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子Pglv介導(dǎo)amyLM以及野生型地衣芽孢桿菌α-淀粉酶基因amyL在WB800n中的表達(dá)。其中，突變