1、干擾素（Interferon，IFN）是一類誘生型分泌性蛋白，具有抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)功能。目前重組干擾素已在大腸桿菌、酵母、昆蟲和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中成功表達(dá)，大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)中，重組蛋白包涵體的復(fù)性和大腸桿菌熱源性等仍是大腸桿菌作為表達(dá)干擾素的宿主菌亟待解決的問題?？莶菅挎邨U菌作為腸道益生菌具有完善的分泌系統(tǒng)，能將外源基因產(chǎn)物分泌至胞外，有利于外源產(chǎn)物的純化和回收。近年來，隨著分子生物學(xué)和基因工程的發(fā)展，它作為基因工程表達(dá)系統(tǒng)發(fā)展

2、迅速，作為新型的藥物或抗原投遞系統(tǒng)也展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。本研究通過克隆固始雞IFN-α基因，進(jìn)而構(gòu)建大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭表達(dá)質(zhì)粒pWBAO-ChIFN-α，并電轉(zhuǎn)化到枯草芽孢桿菌工程菌WB800中。蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)重組ChIFN-α的表達(dá)，微孔板細(xì)胞病變抑制法檢測(cè)其抗病毒活性。
　　試驗(yàn)一大腸桿菌-枯草芽孢桿菌-ChIFN-α穿梭表達(dá)質(zhì)粒pWBAO-ChIFN-α的構(gòu)建。
　　提取免疫后雞只的脾臟RNA通過RT-

3、PCR，克隆489bp正確的雞干擾素α基因。大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建，解決連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入枯草芽孢桿菌效率極低的問題。該穿梭質(zhì)粒是以枯草芽孢桿菌表達(dá)質(zhì)粒pWB980為質(zhì)粒骨架，在pWB980質(zhì)粒sacB信號(hào)肽前插入大腸桿菌的復(fù)制原點(diǎn)和氨芐抗性基因(1800bp)，使其可以在大腸桿菌中復(fù)制。之后在大腸桿菌DH5α中構(gòu)建了大腸桿菌-枯草桿菌-ChIFN-α穿梭表達(dá)質(zhì)粒pWBAO-ChIFN-α。
　　試驗(yàn)二重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化枯草

4、芽孢桿菌的方法探究及表達(dá)條件優(yōu)化。
　　本試驗(yàn)通過化學(xué)轉(zhuǎn)化法和電轉(zhuǎn)化法將pWBAO-ChIFN-α質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入WB800?；瘜W(xué)轉(zhuǎn)化法:通過控制枯草桿菌在不同生長(zhǎng)時(shí)期營(yíng)養(yǎng)的需求，在營(yíng)養(yǎng)貧瘠的情況下制備枯草芽孢桿菌WB800感受態(tài)細(xì)胞，以比較溫和的轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)入表達(dá)質(zhì)粒，該方法獲得2～3個(gè)轉(zhuǎn)化子;電轉(zhuǎn)化法:在高滲溶液中制備WB800感受態(tài)細(xì)胞，以電擊的方式導(dǎo)入表達(dá)質(zhì)粒。電壓的選擇是電擊轉(zhuǎn)化方式是否成敗的關(guān)鍵因素，因此在大量的實(shí)驗(yàn)摸索最后

5、確定電擊轉(zhuǎn)化電壓為1.0～1.2kv/mm，電擊后電擊常數(shù)在4.5～5.5ms。該方法一般情況下在抗性可以獲得10～12個(gè)轉(zhuǎn)化子，經(jīng)菌液PCR檢測(cè)陽(yáng)性率為100％。因此，電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化外源表達(dá)質(zhì)粒的效率高于化學(xué)轉(zhuǎn)化。優(yōu)化枯草芽孢桿菌表達(dá)條件，確定最佳的表達(dá)時(shí)間。
　　試驗(yàn)三檢測(cè)重組雞干擾素α在枯草芽孢桿菌中的表達(dá)和蛋白抗病毒活性。
　　試驗(yàn)分為蔗糖誘導(dǎo)組和非誘導(dǎo)組，前者是在重組菌培養(yǎng)3h后加入終濃度為2％的蔗糖溶液進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)

6、;后者在同樣的條件下培養(yǎng)但無(wú)蔗糖添加。通過SDS-PAGE和蛋白試劑盒檢測(cè)蛋白含量。Western blot檢測(cè)到目的蛋白ChIFN-α的分子質(zhì)量約為20ku的。微量細(xì)胞病變抑制方法檢測(cè)ChIFN-α抗病毒活性:NDV感染MDCK細(xì)胞，設(shè)置空白對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照、實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)組在2-6稀釋孔中細(xì)胞開始出現(xiàn)病變，表明該干擾素最小在2-6稀釋度對(duì)細(xì)胞具有保護(hù)作用，表達(dá)的ChIFN-α具有抗病毒的生物活性。
　　本研究結(jié)果