1、富勒烯獨特的分子結構,使其具有許多優(yōu)異的物理性質,在光、電、磁、藥物化學等方面有著廣闊的應用前景。富勒烯研究幾乎涉及物理學、化學以及材料科學的各個領域,同時對生物學、醫(yī)學等也產生了巨大沖擊,這使富勒烯家族成為當前科學界研究的熱點。本文采用分子設計原理,利用親核加成或氮卡賓等方法,合成了八種生物相容性的C60衍生物,除C60-β-丙氨酸衍生物外,其余C60衍生物均為首次合成,未見文獻報道。首次將以上合成的多種C60衍生物對神經細胞進行離體

2、細胞實驗,用MTT、流式細胞術、熒光探針、熒光顯微鏡等方法測定及觀察神經細胞的形態(tài)結構變化,較深入地研究C60衍生物的微觀結構、幾何尺寸、功能基團的種類與神經細胞老化凋亡之間的關系及規(guī)律,初步探索其抑制神經細胞凋亡的機理,為全新高效抑制神經細胞凋亡的藥物的設計提供新的思路與方法,該研究在化學及生命、材料科學的交叉領域中有重大的理論意義及明確的應用前景。其主要內容包括:
　　1. C60與氨基酸類物質在甲苯/乙醇混和溶劑中的親核加成

3、反應得到水溶性C60氨基酸衍生物(1a,1b,1c,1d,1e),元素分析及LC-MS確定它們的加成度分別為:n=5(1a),7(1b),2(1c),6(1d)和8(1e)。在此反應中,相轉移催化劑四丁基氫氧化胺TBAH能顯著提高反應的速率及產率。以 C60胱氨酸衍生物的合成為例,通過加入 TBAH,C60的轉化率由14.64％提升至50.31%;反應的速率也提高了近3倍。由于親水疏水相互作用及氫鍵力,C60氨基酸衍生物在水中自組裝形成

4、了10-800nm的球狀聚集體。
　　2.利用氮卡賓與C60的加成反應制備了溶解于DMSO的C60氧化型谷胱甘肽衍生物(2a);利用N-羥甲基乙酰胺為巰基保護基團,利用親核加成反應制備了水溶性的C60還原型谷胱甘肽衍生物(2b);利用C60與葉酸在甲苯/乙醇/水混和溶劑中的親核加成反應制備了水溶性的C60葉酸衍生物(2c)。元素分析及LC-MS確定它們的加成度分別為:n=1-2(2a),2(2b),1(2c)。由于親水疏水相互作用

5、,C60基神經細胞保護劑在其溶液中形成了100-500nm的球狀聚集體。
　　3.采用鄰苯三酚自氧化化學發(fā)光體系產生了O2,并檢測了生物相容性C60衍生物清除O2的活性。生物相容性C60衍生物能明顯清除化學發(fā)光體系中產生的O2活性氧自由基。清除活性2a>2b>1a>1d>1b>2c>1c>1e。采用鄰菲羅啉化學發(fā)光體系產生了OH,并檢測了生物相容性C60衍生物清除-OH的活性。清除活性2a>2b>1a>1d>1b>1c>1e>2c

6、。研究顯示:C60衍生物清除自由基的活性與母體C60上剩余π鍵數(shù)目、加成基團位阻效應、加成基團電子效應、加成基團與ROS反應活性及生物相容性C60衍生物溶液中的聚集狀態(tài)息息相關。
　　4.利用RF光譜檢測了1a,1b,1e三種C60氨基酸衍生物在細胞內外含量;利用DCF-DA為熒光探針,流式細胞計為測試手段檢測了1a,1b,1e對于細胞內活性氧自由基的清除效率;利用MTT、PI染色流式細胞技術、Hoechst33342/PI染色熒

7、光照相等方法,檢測了1a,1b,1e對于H2O2誘導的PC12細胞凋亡的抑制作用。結果顯示,1a,1b,1e生物相容性良好,且能有效的保護由活性氧聚集引起的PC12細胞的損傷,保護活性1b>1a>1e。在本研究中,較深入的研究了C60衍生物的聚集狀態(tài)對其抑制神經細胞凋亡活性的影響。C60氨基酸衍生物的神經細胞保護活性與其清除活性氧自由基效率及聚集狀態(tài)息息相關。
　　利用Tietze還原酶法檢測了C60氧化型谷胱甘肽衍生物2a對細胞

8、GSH水平的影響;檢測2a對神經細胞凋亡抑制作用實驗類同于C60氨基酸衍生物的檢測方法。結果顯示,2a在抗氧化及神經保護活性方面高于相應的母體GSSG,其提高的幅度較為明顯,約為30%。
　　利用細胞計數(shù)、細胞形態(tài)學觀察、MTT法等檢測 C60還原型谷胱甘肽衍生物2b對于N2a細胞增殖與活力的影響;利用分光光度法檢測2b對于N2a細胞中Caspase3酶活性的影響;利用Annexin V-FITC/PI染色流式細胞技術,檢測了2b

9、對于H2O2誘導的N2a細胞凋亡的抑制作用。結果顯示,2b有利于N2a的增殖與活力,能顯著降低H2O2引起的Caspase3酶活性增高,并且能抑制由H2O2引起的細胞凋亡。2b具有抑制細胞凋亡作用,且強于谷胱甘肽及C60氨基酸水溶性衍生物。
　　檢測C60葉酸衍生物2c對神經細胞凋亡抑制作用實驗類同于C60氨基酸衍生物的檢測方法。結果顯示,2c清除ROS的性能并不十分出色,但其對H2O2誘導PC12細胞凋亡的抑制作用依然出色,這可