1、Forkhead家族蛋白是一類含有一個保守的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域為特征的轉(zhuǎn)錄調(diào)控子家族,存在于所有的真核生物中。在Forkhead轉(zhuǎn)錄因子家族中,FoxO亞族包括Fox01,Fox03,Fox04和Fox06四個成員。通過酵母雙雜交實驗,我們得到一個新的FoxO結(jié)合蛋白,并將其命名為FBPl。在HEK293T細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)Flag標(biāo)簽的FoxO蛋白家族成員FoxO1,FoxO3a,FoxO4,然后通過免疫沉淀反應(yīng)實驗分析,我們發(fā)現(xiàn)FoxO蛋白

2、家族成員分別能免疫沉淀內(nèi)源性的FBP1蛋白。為了探究FoxO蛋白家族成員FoxO1蛋白與FBP1蛋白之間是否有直接的相互作用,我們將人的FoxO1基因和人的FBP1基因序列分別克隆到pGEX4T-1和pET21b載體上,并進(jìn)行體外蛋白誘導(dǎo)表達(dá),通過GST-pulldown實驗驗證了FoxO1蛋白與FBP1蛋白之間有直接的相互作用。通過His-pulldown實驗進(jìn)一步確定了FoxO1蛋白與FBP1蛋白相互作用的結(jié)構(gòu)域位于FoxO1蛋白的

3、DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域,即aa150-270。
　　 我們進(jìn)一步設(shè)計如下實驗來探討FoxO1-FBP1復(fù)合體的生物學(xué)效應(yīng)。在HCT116細(xì)胞中,敲低FoxO1基因并不影響FBP1蛋白的表達(dá),而敲低FBP1基因則導(dǎo)致FoxO1蛋白水平的降低,提示FBP1蛋白有可能影響FoxO1的表達(dá)水平。由于FoxO1參與細(xì)胞自噬的代謝過程,且FBP1對FoxO1蛋白水平有調(diào)節(jié)的作用,這些證據(jù)提示FBP1有可能與細(xì)胞自噬有關(guān)。為了驗證該假設(shè),我們在FB