1、以哺乳動物細(xì)胞為宿主,反應(yīng)器培養(yǎng)進(jìn)行重組蛋白藥物的生產(chǎn),已經(jīng)成為生物制藥的主要技術(shù),目前國際上已有80％以上的重組蛋白藥物通過哺乳動物細(xì)胞表達(dá)。相比細(xì)菌和酵母菌,哺乳動物細(xì)胞對各種應(yīng)激環(huán)境的耐受力差,對培養(yǎng)環(huán)境的嚴(yán)格要求限制了大規(guī)模培養(yǎng),提高了生產(chǎn)成本。在對細(xì)胞增殖、凋亡、代謝等機(jī)理認(rèn)識的基礎(chǔ)上,找到合適的靶點對細(xì)胞進(jìn)行遺傳改造,使其更適合工業(yè)化培養(yǎng),是生物工程的重要研究內(nèi)容。結(jié)合本實驗室以往的研究,以及文獻(xiàn)報道,我們推測應(yīng)激響應(yīng)分子—

2、MGF有望作為提高宿主細(xì)胞應(yīng)激耐受力的靶點得到利用。本研究利用MGF基因遺傳重構(gòu)了CHO-K1宿主細(xì)胞,并評價了重組細(xì)胞對多種應(yīng)激環(huán)境的耐受能力,主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下:
　　1. PCR擴(kuò)增MGF表達(dá)序列 BamHI和AscI雙酶切插入含GFP標(biāo)簽的慢病毒pLenti6.3_MCS質(zhì)粒,構(gòu)建慢病毒重組質(zhì)粒pL-GFP-MGF。鑒定序列正確的基礎(chǔ)上與包裝質(zhì)粒一起共轉(zhuǎn)化293T細(xì)胞,包裝獲得重組病毒LV-MGF和空病毒LV-null

3、。高速梯度離心獲得純化病毒,滴度達(dá)到1.25×108和2×107。
　　2. Polybrene介導(dǎo)病毒MOI值為5感染CHO-K1細(xì)胞,獲得50％以上的感染率,在8μg/ml blasticidin選擇壓力下,持續(xù)培養(yǎng)2周,篩選獲得穩(wěn)定克隆。Western blot實驗證實所篩選的克隆株能高水平表達(dá)MGF,命名CHO-MGF,空病毒感染株命名為CHO-null;
　　3.分別模擬無血清培養(yǎng)基、消耗過培養(yǎng)基和酸堿培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)

4、胞培養(yǎng),從細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞活力以及葡萄糖與乳酸代謝角度評價CHO-MGF、CHO-null以及親本細(xì)胞 CHO-K1對三種應(yīng)激環(huán)境的耐受力:
　　(1)在無血清的培養(yǎng)環(huán)境下,MTT實驗與細(xì)胞周期結(jié)果顯示,CHO-MGF較CHO-null、CHO-K1細(xì)胞具有更高的增殖能力;經(jīng)過48h的無血清培養(yǎng),流式細(xì)胞儀與臺盼藍(lán)拒染實驗分別測定三種細(xì)胞的凋亡率與細(xì)胞存活率,結(jié)果顯示, MGF能夠提高CHO-K1細(xì)胞的無血清耐受

5、力;使用SBA生物傳感分析儀,測定經(jīng)過三種細(xì)胞消耗過培養(yǎng)基中葡萄糖與乳酸的濃度,間接地證明了,CHO-MGF具有比較高的增殖速度,同時,也意味著重組力生長因子能夠提高 CHO-K1細(xì)胞的乳酸適應(yīng)力;
　　(2)通過培養(yǎng)CHO-K1細(xì)胞的方式制備了模擬哺乳動物分批培養(yǎng)后期營養(yǎng)物質(zhì)消耗的培養(yǎng)環(huán)境(Spent medium);通過MTT實驗、流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞周期實驗測定三種細(xì)胞的增殖能力,結(jié)果顯示,CHO-MGF細(xì)胞較 CHO-nul

6、l、CHO-K1細(xì)胞在營養(yǎng)物質(zhì)消耗的培養(yǎng)條件下有更高的增殖能力,另外,葡萄糖濃度測定結(jié)果也證明了重組表達(dá)MGF能提高;通過流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡與臺盼藍(lán)拒染實驗測定細(xì)胞存活率,證明重組MGF能提高宿主細(xì)胞對營養(yǎng)物質(zhì)消耗培養(yǎng)環(huán)境的抗凋亡能力;乳酸濃度測定實驗表明CHO-MGF細(xì)胞較CHO-null和CHO-K1細(xì)胞具有更強(qiáng)的乳酸耐受力;
　　(3)通過MTT實驗制備了模擬哺乳動物宿主細(xì)胞的酸堿培養(yǎng)環(huán)境;MTT實驗和流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞

7、周期實驗顯示CHO-MGF細(xì)胞較CHO-null、CHO-K1細(xì)胞具有更高的增殖能力,葡萄糖濃度測定實驗也間接地證明了重組MGF能提高哺乳動物宿主細(xì)胞的增殖速度;流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡實驗表明,過表達(dá)MGF能提高哺乳動物宿主細(xì)胞酸堿培養(yǎng)環(huán)境的抗凋亡能力,臺盼藍(lán)拒染實驗也證明了這一結(jié)論。
　　綜上所述,本研究以慢病毒為載體,構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)MGF的CHO-K1細(xì)胞株,與對照組細(xì)胞相比,該重組細(xì)胞能更好的適應(yīng)無血清培養(yǎng)、spend-me