1、microRNAs(miRNAs)是存在于真核生物中具有調(diào)控功能的內(nèi)源性非編碼RNA，大小通常為19-25個長度的核苷酸。研究表明，miRNA通過堿基互補配對原理調(diào)控靶基因mRNA表達，參與調(diào)節(jié)細胞增殖、凋亡、遷移、脂肪代謝及胚胎器官形成等多種生理功能。miR-218（miRNA-218）是一種首先被發(fā)現(xiàn)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中有高表達的miRNA，目前關(guān)于miR-218的研究主要集中在惡性膠質(zhì)細胞瘤，miR-218可以通過調(diào)節(jié)不同靶基因參與調(diào)

2、控膠質(zhì)瘤細胞的侵襲、遷移、增殖及腫瘤干細胞的全能性，這已成為惡性膠質(zhì)細胞瘤臨床研究的一個熱點。而在心臟發(fā)育領(lǐng)域，近幾年僅有少量關(guān)于miR-218相關(guān)研究報道。在斑馬魚胚胎發(fā)育過程中，miR-218可以通過與Tbx5之間互相調(diào)控而影響心臟發(fā)育，miR-218表達被抑制后可以抵消部分由于TBX5過表達后引起的心臟循環(huán)發(fā)育阻滯。過表達miR-218后可引起斑馬魚胚胎心臟發(fā)育畸形、心房發(fā)育不全、心室間隔無法正常形成等現(xiàn)象。但miR-218可能調(diào)

3、控的靶基因及參與心肌細胞分化的作用機制尚未完全闡明。并且斑馬魚細胞中miR-218分型與哺乳動物細胞中miR-218分型不同，斑馬魚細胞中miR-218不同亞型參與心臟發(fā)育不同過程的調(diào)控。因此，亟待在哺乳動物胚胎發(fā)育代表性強的體系中加以研究。小鼠胚胎干(embryonic stem，ES)細胞自首次從小鼠胚囊內(nèi)層細胞中發(fā)現(xiàn)后，因可以在體外適宜條件下無限制增殖并具有分化成所有體細胞的全能性而在各種研究中得到廣泛應用。已有報道m(xù)iR-1和m

4、iR-133參與調(diào)控胚胎心肌分化發(fā)育及心血管的形成，Let-7家族也可參與調(diào)控心血管疾病的發(fā)生及ES細胞定向心肌分化過程。miR-218參與調(diào)控ES細胞全能性的維持。另在口腔鱗狀細胞癌中miR-218通過靶基因Rictor參與調(diào)控腫瘤的發(fā)生和遷移。而干細胞與腫瘤細胞之間存在著驚人的相似性，因此，影響腫瘤細胞增殖、凋亡、遷移等功能的某些信號調(diào)控網(wǎng)絡，在控制干細胞功能中同樣發(fā)揮著重要作用。ES細胞體外定向心肌細胞分化過程伴隨著細胞遷移運動，

5、擬胚體(embryonid bodies，EBs)的形成過程模擬了ES細胞體內(nèi)形成三胚層原腸胚的過程，其中涉及包括細胞的分裂增殖，遷移，聚集和重排在內(nèi)的一系列形態(tài)發(fā)生運動。有文獻表明，miR-124參與EBs形成過程中細胞遷移的調(diào)控，miR-124表達上調(diào)后抑制EB鋪展以及ES細胞遷移，并抑制ES細胞分化。miR-218可以通過靶基因Robo1調(diào)控Slit/Robo1信號通路，并調(diào)節(jié)遷移相關(guān)蛋白Cdc42和黏附相關(guān)蛋白Rac1的表達，影

6、響惡性膠質(zhì)細胞瘤細胞的遷移。但迄今尚未見有關(guān)miR-218對ES細胞定向分化心肌細胞及分化中伴隨的細胞遷移作用報道。本研究主要利用小鼠ES細胞體外定向分化為心肌細胞模型，探索miR-218在ES細胞定向心肌細胞分化過程中的調(diào)控作用，并進一步采用生物信息學方法，通過miRNA靶基因數(shù)據(jù)庫如Targetscan、miRanda、Pictar等，對特定miRNA可能的靶基因進行序列分析及預測，并采用miRNA分析數(shù)據(jù)庫如miRPath、Tar

7、base和MicroT-CDS等對靶基因進行功能分類，并利用PCR法對預測結(jié)果進行基因表達水平的鑒定。旨在闡明miR-218表達調(diào)控與ES細胞分化為心肌細胞間的關(guān)系，揭示miR-218潛在可能參與調(diào)控心肌分化過程的靶基因，為深入研究miR-218在ES細胞分化中的作用機制提供實驗依據(jù)。
　　目的：探索miR-218對小鼠ES細胞定向分化心肌細胞的調(diào)控作用及miR-218潛在可能參與調(diào)控心肌細胞分化的靶基因。闡明miR-218表達調(diào)

8、控與ES細胞分化為心肌細胞間的相關(guān)性，揭示ES細胞分化過程中miR-218轉(zhuǎn)錄后調(diào)控分子信息。
　　方法：采用經(jīng)典的“懸滴培養(yǎng)-懸浮培養(yǎng)-貼壁培養(yǎng)”三步法ES細胞定向心肌細胞分化模型，利用miR-218擬似物(miR-218 mimic)和miR-218抑制劑（miR-218 inhibitor）分別轉(zhuǎn)染小鼠ES細胞，檢測搏動心肌細胞團分化率變化，并運用免疫印跡技術(shù)、流式細胞術(shù)和免疫熒光染色法檢測小鼠ES細胞中miR-218的表達

9、調(diào)控與心肌細胞定向分化過程中心肌特異性轉(zhuǎn)錄因子及心肌細胞特異性蛋白水平的表達，心肌細胞數(shù)量，鈣離子通道相關(guān)蛋白表達變化及心肌肌小節(jié)成熟結(jié)構(gòu)的形成情況。采用活細胞工作站測定分化來的心肌細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+瞬變。通過生物信息學分析ES細胞中可能與miR-218互補結(jié)合的靶基因序列，并運用RT-PCR及qRT-PCR檢測miR-218 mimic對部分預測出可能靶基因的表達水平影響。根據(jù)預測結(jié)果，進而利用劃痕法和Transwell法檢測miR-

10、218對ES細胞體外分化中伴隨的遷移現(xiàn)象的調(diào)控作用，并用免疫印跡技術(shù)探究miR-218對ES細胞定向心肌分化過程中細胞遷移相關(guān)蛋白的影響。
　　結(jié)果：⑴miR-218 mimic轉(zhuǎn)染小鼠ES細胞后，抑制心肌細胞分化，在day5+2和day5+3時心肌細胞分化率分別為12±3％和32±7％，較陰性對照組29±4％和56±5％顯著減少（P＜0.01）。中胚層特異性標記蛋白brachyury，心肌特異性轉(zhuǎn)錄因子Nkx2.5、GATA4、

11、TBX5，肌小節(jié)結(jié)構(gòu)蛋白α-Actinin，竇房結(jié)樣心肌細胞特異性蛋白HCN4，心房樣心肌細胞特異性蛋白ANP及心室樣心肌細胞特異性蛋白MLC-2v，橋粒蛋白Desmoplakin，間隙連接蛋白Cx43和鈣相關(guān)蛋白N-cadherin的表達均呈現(xiàn)顯著性下降。同時，miR-218 mimic顯著降低day5+3心肌細胞內(nèi)咖啡因刺激后Ca2+瞬變幅度。流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，ES細胞轉(zhuǎn)染miR-218 mimic后分化成心肌細胞數(shù)量減少。并

12、且，免疫熒光結(jié)果顯示miR-218 mimic組分化而來的心肌細胞肌小節(jié)結(jié)構(gòu)紊亂。而miR-218 inhibitor轉(zhuǎn)染ES細胞后，能促進心肌細胞分化時相提前。在day5+1時就出現(xiàn)搏動心肌細胞團，分化率為4±3％。在day5+2和day5+3時心肌細胞分化率分別為68±4％和84±8％，較陰性對照組29±5％和56±7％顯著增加（P＜0.01）。miR-218 inhibitor促進中胚層特異性標記蛋白brachyury的表達，Nk

13、x2.5、GATA4、TBX5、α-Actinin、HCN4、ANP、MLC-2v、L-type Ca2+ CPα1D、CaMKⅡδ、Desmoplakin、Cx43和N-cadherin蛋白表達水平均上調(diào)。miR-218 inhibitor增加α-Actinin陽性表達的心肌細胞數(shù)，且促進分化而來的細胞肌小節(jié)結(jié)構(gòu)清晰完整，顯著提高day5+3心肌細胞內(nèi)Ca2+瞬變幅度。⑵生物信息學方法預測分析出164個miR-218的可能靶基因，經(jīng)m

14、iRNA功能分析數(shù)據(jù)庫miRPath發(fā)現(xiàn)miR-218參與調(diào)控20條信號通路。結(jié)合預測結(jié)果及文獻報道，選擇了其中四條與心肌分化相關(guān)的信號通路中部分靶基因進行基因水平的驗證，具體包括磷脂酰肌醇信號系統(tǒng)(Phosphatidylinositol signaling system)，谷氨酸的突觸調(diào)控通路（Glutamatergic synapse），細胞間連接(Gap junction)和mTOR信號調(diào)控系統(tǒng)中的Rictor、Pik3r1、P

15、i4k2a、Adcy1、Shank2、Pdgfr-α、Grm1和Gnai2。PCR結(jié)果顯示，miR-218 mimic可以顯著下調(diào)Rictor、Pik3r1、Shank2、Pdgfr-α、Grm1基因水平的表達。⑶基于miR-218靶基因預測并驗證出的靶基因Pdgfr-α、Grm1和Rictor，結(jié)合文獻報道，其可以參與心肌分化發(fā)育調(diào)控，并調(diào)控腫瘤細胞遷移，同時細胞遷移在小鼠ES細胞定向心肌分化發(fā)育過程中也發(fā)揮著重要的作用，本實驗對mi

16、R-218表達與小鼠ES細胞心肌分化中的遷移能力調(diào)控進行了進一步的探究。在小鼠ES細胞定向心肌細胞分化過程中，miR-218 mimic組EBs鋪展遷移最遠細胞距EBs邊緣的平均距離為431.1μm，顯著大于對照組EBs細胞遷移平均距離350.1μm，miR-218表達上調(diào)促進EBs細胞遷移，miR-218 inhibitor組EBs細胞遷移距離為235.9μm，顯著小于對照組遷移距離318.7μm。體外劃痕實驗結(jié)果顯示，miR-218

17、mimic轉(zhuǎn)染后ES細胞遷移距離在12 h和24 h較陰性對照組都有顯著增加，劃痕愈合面積比增大。Transwell實驗結(jié)果顯示，miR-218 mimic組平均每個視野遷移的ES細胞數(shù)目為180個，較陰性對照組的120個顯著增加，提示miR-218mimic具有促進小鼠ES細胞體外遷移作用。該作用可能與miR-218通過下調(diào)靶基因Grm1，Pdgfr-α及Rictor的表達，進而抑制細胞遷移相關(guān)蛋白Rac1和Cdc42表達有關(guān)。

18、>　　結(jié)論：①在小鼠ES細胞體外定向分化為心肌細胞過程中，miR-218表達量與心肌分化密切相關(guān)，miR-218 mimic可抑制ES細胞定向中胚層分化，抑制心肌細胞分化。而miR-218 inhibitor的作用則相反。②通過生物信息學方法預測發(fā)現(xiàn)miR-218可能參與細胞內(nèi)20條信號通路的164個基因的表達調(diào)控。其中與心肌分化相關(guān)的4條信號通路中，miR-218 mimic可以顯著下調(diào)Rictor、Pik3r1、Shank2、Pdg

19、fr-α、Grm1基因水平的表達，可作為miR-218調(diào)控ES細胞定向分化心肌細胞作用機制的重要靶點進行深入研究。③miR-218表達量與ES細胞定向心肌分化過程中EB細胞的鋪展能力相關(guān)，miR-218 mimic可以促進ES細胞的體外遷移能力，miR-218 inhibitor的作用則相反。miR-218參與ES細胞遷移的調(diào)控作用可能與調(diào)節(jié)靶基因Grm1、Pdgfr-α和Rictor表達，影響細胞遷移相關(guān)蛋白Rac1和Cdc42表達有