1、登革病毒（denguevirus，DENV）屬于黃病毒科(Flavivirade)黃病毒屬（Flavivirus），主要的傳播途徑是通過蚊蟲叮咬敏感的脊椎動物宿主。DENV根據血清抗原反應分可為四個血清型，分別為DENV-1、DENV-2、DENV-3和DENV-4型。各型病毒感染后均可引起的癥狀主要有登革熱(denguefever，DF)、登革出血熱(denguehemorrhagicfever，DHF)和登革休克綜合征(dengue

2、shocksyndrome,DSS)。
　　 登革病毒的傳播在早期較為局限，主要在熱帶和亞熱帶地區(qū)。但隨著世界經濟的一體化和各國之間的交流增強，登革病毒的傳播范圍日益擴大，目前在非洲、美洲、東南亞和西大平洋地區(qū)一百多個國家和地區(qū)均出現過登革病毒的流行。調查數據顯示，全世界每年約有0.5-1億人感染登革病毒，出現登革出血熱癥狀的嚴重病例達50萬人，2-2.5萬人死亡，其中大多為兒童，死亡率為5％。因此，登革病毒的感染已成為全球重要

3、的公共衛(wèi)生問題，如何有效控制感染是解決這一問題的關鍵。
　　 人體在感染登革病毒后，可以無癥狀，也可只出現類似感冒癥狀，可自愈，稍重的是出現DF癥狀，這些病例主要出現在初次感染的患者，兒童患者多需要住院治療。有相當部分二次感染的患者可以出現嚴重的病癥DHF/DSS。目前還沒有一個特異性的治療方法，患者只能對癥治療，也缺乏有效的疫苗來防止感染。根據目前的研究結果顯示，出現DHF和DSS的主要原因是抗體依賴增強(antibody-d

4、ependentinhancment，ADE)效應，而其根源是登革病毒存在四個不同的血清型。研究認為，病人感染其中一型病毒后，免疫系統會產生眾多對各種血清型病毒有交叉反應的抗體，這些抗體短期內有一定的交叉保護性作用，但并不具有長期保護性作用。相反的，這些與其他血清型病毒有交叉反應性的非中和抗體或者是一些亞中和濃度抗體可能就是引起DHF/DSS的重要原因。這些抗體與病毒顆粒結構蛋白結合后，不能阻止病毒進入細胞，而其Fc部分會與某些細胞（如

5、單核細胞或樹突狀細胞）膜上的Fc受體結合，這種結合有助于登革熱病毒進入細胞，增強細胞對病毒的攝取及病毒在細胞內的復制，導致感染的增強，從而促使登革的嚴重疾病的發(fā)生。對于防止登革疾病傳播的疫苗研發(fā)中，如果僅對一型病毒進行抗感染保護，會在病人感染異型病毒時，產生的ADE效應將會影響病人的生命。因此，各種類型的疫苗是否是引起ADE效應是登革防疫研究中一個關鍵點。
　　 登革病毒從首次分離至今，已有六十余年，但對其感染后疾病的防治還存在

6、較大困難。其中的最大障礙是對登革病毒感染后的機體免疫機制不明，研究的針對性不能集中。登革病毒的基因組結構是單股正鏈RNA分子，長約11000nt，編碼三個結構蛋白，分別為衣殼蛋白(C)、膜蛋白(M)和包膜蛋白(E)，七個非結構蛋白（non-structureprotein，NS），分別為NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5。結構蛋白中的E蛋白與病毒感染有關，主要是與靶細胞表面的病毒受體結合，參與病毒與細胞之間的

7、膜融合。在非結構蛋白中，雖然它們并不是成熟病毒顆粒的組成成份，但從目前的研究成果看來，它們在病毒感染與機體的免疫過程中起重要的作用。其中特別受到重視的是NS1蛋白，它是登革病毒中主要的非結構蛋白，通常有三個形式存在，一為分泌型，可以直接由感染的細胞分泌到胞外，可用于登革病毒早期診斷指標。二為胞內型，主要存在于細胞內生物腔膜上，三為膜型，存在于感染細胞膜上，它的功能推測可以通過細胞毒作用，直接參與病毒的清除，另外，也可能在病毒RNA的復制

8、中起一定作用，但因為對其的蛋白結構未完成了解，與抗體的結合形式不清楚，所以其真正功能還需進一步研究。在抗原蛋白的結構未完全闡明之前，可以利用各種技術分析預測它們的二級結構，如冷凍電鏡、酵母展示、點突變和多肽結合位點分析等。本研究利用合成的NS1重疊多肽與148株NS1單克隆抗體進行結合反應，可以得到單抗的線性結合位點。依據這些單抗的結合位點的特性，如一個單抗與多個位點結合，表明這些位點的物理位置是相近的，從而可以構建出NS1抗原蛋白的拓

9、撲圖。同時，我們也用流式細胞術，篩查各抗體與感染后細胞的表達的NS1蛋白抗原的結合類型，了解有哪些抗體是可以與感染細胞膜表面抗原進行結合的，從而可以為解釋NS1蛋白在登革病毒感染免疫機制中的作用奠定基礎。
　　 疫苗是一個有效預防感染性疾病的方式。如前所述，登革病毒存在四個不同的血清型，病人在二次感染異型病毒時，會產生嚴重的疾病，因此，疫苗的研制除了要有良好的中和保護作用外，還必須驗證是否存在ADE效應。從目前的研究來看，無論是

10、單一價的疫苗或多價疫苗，能同時符合這兩個要求的疫苗還沒有面世。在疫苗的研究中，中和實驗是病毒研究中應用相當普遍的技術。傳統的方法是蝕斑減少中和實驗(plaquereducingneutralizationtest，PRNT)，但這種方法費時費力，對結果的判斷較為主觀，許多研究者在開發(fā)一些可以替代它的方法。包括有基于流式細胞術的方法、基于ELISA技術的方法等。這些方法雖然是可以省時省力，但也存在一些問題，如病毒用量遠比PRNT大。另外，

11、在實際應用中，并不是所有的病毒特別是一些臨床分離株，重復性較差。新近有研究者結合前期開發(fā)主要用于原位檢測細胞因子分泌的技術一-基于酶聯免疫斑點分析(enzyme-linkedimmunospot-basedmicroneutralizationassay,ELISPOT)的微中和實驗。本研究將從實際應用出發(fā)，建立和評價這一種技術，并應用這一方法檢測臨床收集的29例1型登革病毒感染患者恢復期血清的中和效價。
　　 本研究共分為如下

12、三個部分:
　　 第一部分:分析登革病毒NS1抗體結合位點構建NS1拓撲圖
　　 登革病毒NS1蛋白在登革病毒感染后免疫機制中的作用越來越受到重視，主要原因是它不是病毒顆粒的組成成份，可以避免引起ADE效應。它有多種表達形式，其中在感染細胞膜表面表達的部分，研究認為可能介導細胞殺傷功能而在病毒清除中起重要作用。研究結果顯示，NS1蛋白應有三個區(qū)域，分別為RⅠ、RⅡ和RⅢ，但因其結構尚未解晰，對于它的真正分區(qū)功能未能從理論

13、或實驗中得到充分的證明。本研究合成DENV-1NS1的重疊多肽（每條多肽與上一多肽重疊5個氨基酸，最后一條重疊8個氨基酸，共35條），檢測它們與148株NS1單克隆抗體的結合情況，分析它們的結合位點。檢測結果表明，148株抗體中，有82株抗體可以與多肽進行結合，其中有七株抗體具有結合兩個區(qū)域，具體為1A11A9、2E8A5與RⅠ區(qū)的1肽和RⅡ22肽結合，6D14A4與RⅠ區(qū)的1肽、14肽和RⅡ區(qū)的22肽結合，1F32A1與RⅠ區(qū)的1肽和

14、RⅡ區(qū)的31肽結合，7E1A4和7E9A2與RⅠ區(qū)的5肽和RⅢ區(qū)的27肽結合，1B7A1與RⅡ區(qū)的22肽和RⅢ區(qū)的32肽結合，三個區(qū)域相互之間有密切連接位點。利用以上多肽結合的位點，根據單抗結合位點在物理位置上的相近性，我們構建出NS1抗原蛋白的二級結構模擬圖。另外，研究證明WNV的NS1抗體可以通過抗體依賴細胞殺傷功能對感染細胞進行吞噬清除，其基礎是此抗體須與N在細胞表面表達NS1進行結合。我們用流式細胞術分析了以上148株抗體與感染

15、病毒后細胞膜表面的NS1蛋白結合情況。結果顯示，分別有92株、87株、75株和91株抗體與同型病毒感染后細胞膜表面的NS1蛋白結合。按照單抗與多肽的結合位點結果，針對RⅡ區(qū)結合的單抗，有82％(18/22)的抗體可以與DENV1-4任一型或多型病毒感染后細胞膜上抗原結合，而針對結合RⅠ和RⅢ的抗體，分別有60％(29/48)和54％(6/11)的抗體可與膜抗原結合。這一結合模式可能與膜型NS1蛋白在感染細胞膜上嵌合形式有關。我們的研究結

16、果與前期對黃病毒NS1的研究數據基本一致。這些數據可為研究NS1的功能和NS1抗體應用打下堅實基礎。
　　 第二部分:酶聯免疫斑點微中和實驗方法檢測登革病毒抗體中和活性方法的建立與評價
　　 目前中和實驗的金標準方法是PRNT方法，這一方法在六孔板中進行，在病毒感染細胞后，需要在7-10天的時間孵育來形成可以用于檢測的蝕斑。如果要完成大量的中和實驗標本，這一方法將相當耗時而且結果判斷主觀性強。微中和實驗是一個應用較多的高

17、通量檢測方法，這些實驗是在96孔板中完成。本研究將評價一個新近開發(fā)的基于ELISPOT技術的微中和實驗方法，并建立用于檢測抗體或血清對登革病毒的中和活性的方法學。按照該法的基本原理是病毒感染細胞后，細胞表面可在較短時間內表達NS1蛋白，將細胞固定處理后，利用抗NS1的抗體可以建立ELISA檢測方法，最后用固體原位顯色方法可以通過斑點的形成指示病毒對細胞的感染情況。選用VEROE6細胞為病毒感染的靶細胞，通過對病毒加入量和登革各型病毒在感

18、染后的孵育時間的條件優(yōu)化，建立了ELISPOT方法檢測登革各型病毒的方法學。方法學建立后，我們對33株抗登革病毒EDⅢ單克隆抗體針對四個血清型的中和活性檢測，然后再從中選擇十株單抗進行PRNT檢測它們針對各型病毒的中和活性，兩種檢測方法應用相同病毒株、抗體稀釋梯度進行，并對檢測結果進行對比分析。結果顯示，基于ELISPOT方法可以在96孔板中加入200PFUs病毒的情況下，形成的斑點清晰可辨，登革病毒四個血清型有不同的感染后孵育時間，D

19、ENV-1為4天，DENV-2和DENV-4為2天，DENV-3為3天。對比兩種方法，它們之間的相關性較好，r=0.863，P＜0.001;如果以PRNT方法為標準，我們將其結果與ELISPOT方法結果進行卡方檢驗(McNemar)，結果顯示ELISPOT與PRNT結果無顯著性差別（P＜1.000）。ELISPOT微中和實驗檢測這10株單抗針對四型登革病毒的中和效價的敏感性和特異性分別為95.6％(22/23)and88.24％(15/

20、17)。如此可見，基于ELISPOT的微中和實驗可以應用于四型登革病毒的中和活性實驗檢測，而且這種方法省時省力，適合進行批量篩查。
　　 第三部分:Ⅰ型登革病毒感染患者康復期血清中和效價分析
　　 對登革病毒引起的疾病目前還未有特異高效的治療方法或藥物，因目前也沒有一個能良好復制登革病毒感染后癥狀的動物模型，使疫苗的研制存在一定的困難。人體在自然感染登革病毒后，免疫狀態(tài)的維持可以從一個側面了解機體的抗病毒機制。本研究收集

21、了29例在2006年感染1登革病毒的患者恢復期血清（2010年獲?。?，利用本實驗室建立和評價的ELISPOT微中和實驗方法，檢測它們針對四型登革病毒的中和效價，并對結果進行對比。結果顯示，大部分血清對四型病毒有交叉中和活性，對四型登革病毒的中和效價（IC50，血清稀釋度倒數）進行非參數檢驗（Kruska-WallisH），結果顯示，四組中和活性有顯著性差異(x2=21.134,P＜0.001)，其中對同型(DENV-1)的中和活性最高，

22、對DENV-4的中和活性最低。結果表明，機體在感染一種血清型病毒后，對四型病毒均有可能存在一定的四型交叉中和活性，但對同型病毒的中和活性強，而對其他型病的中和活性較弱。這些弱中和活性的交叉抗體，可能會在機體受二次異型病毒感染時引起ADE效應。
　　 小結:
　　 綜上所述，本研究在以下方面取得成果:
　　 1、我們合成DENV-1NS1的重疊多肽35條，與148株NS1單克隆抗體進行結合，分析它們的結合位點，有七

23、株抗體的結合位點在不同的兩個區(qū)域，根據這些位點的物理位置相近性，成功構建出NS1蛋白抗原結構二級結構模擬圖，結果與前期對黃病毒NS1蛋白的研究結果一致。研究結果可以在蛋白結晶之前增加對它基本結構的了解。我們還應用流式分析術，篩查了148株單抗與感染細胞膜型NS1抗原結合情況，得到抗體對各型病毒感染分泌于膜上NS1抗原的結合模式。結果顯示，分別有92、87、75和91株抗體與同型病毒感染后細胞膜表面的NS1蛋白結合，針對RⅡ區(qū)結合的單抗，

24、有82％的抗體可以與DENV1-4任一型或多型病毒感染后細胞膜上抗原結合(18/22)，而針對結合RⅠ和RⅢ的抗體，有60％(29/48)和54％(6/11)的抗體可與膜抗原結合，這些結合模式可能與NS1蛋白在感染細胞膜上的嵌合模式有關。
　　 2、建立了基于ELISPOT技術的微中和實驗方法檢測平臺，可以為登革病毒和其他相關病毒提供快速高通量的中和效價測定支撐。同時，我們也對此方法進行評價，對比PRNT方法，方法的特異性和敏感