1、目的：研究多巴胺D2樣受體激動劑對多巴胺能細胞自噬水平和α-synuclein等易聚集蛋白降解的調控及其分子機制。
　　方法：離體實驗以多種多巴胺能細胞株如PC12、MES23.5、SH-SY5Y和原代培養(yǎng)的大鼠中腦神經元為工具細胞，其中PC12細胞為主要研究對象；以多巴胺受體激動劑普拉克索和喹吡羅，以及多巴胺 D2、D3受體特異性拮抗劑為工具藥;Western Blot檢測各種蛋白的表達或磷酸化水平的變化；用維甲酸(RA)聯(lián)合佛

2、波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(TPA)誘導SH-SY5Y細胞分化；普通和定量PCR檢測不同細胞內D2樣受體和BECN1的mRNA水平變化；CCK-8檢測細胞活力,以cleaved caspase-3蛋白表達水平變化評價細胞凋亡情況；激光共聚焦觀察細胞內EGFP-LC3、GFP-RFP-LC3點狀聚集和多巴胺D2、D3亞型受體的定位和分布情況；透射電鏡觀察細胞內自噬小體的形成情況；鈣成像儀動態(tài)監(jiān)測細胞內游離鈣離子水平；瞬時轉染技術干擾

3、和過表達Beclin1以及c-Fos；免疫共沉淀（Co-IP）觀察Beclin1和PtdIns3K蛋白相互作用情況；染色質免疫共沉淀（ChIP）觀察c-Fos蛋白和BECN1啟動子的結合情況；熒光素酶雙標實驗檢測BECN1啟動子的活性；以攜帶WT和A53T、A30P突變型SNCA的慢病毒感染PC12細胞誘導α-synuclein過表達；以攜帶Htt-552-18Q、Htt-552-100Q的腺病毒感染PC12細胞誘導Htt-552蛋白過

4、表達。在體以15月齡的野生型和 A53T-SNCA轉基因小鼠為研究對象；以腹腔注射0.5 mg/kg的普拉克索，每天注射兩次，持續(xù)3周給藥，用等體積的生理鹽水作為陰性對照組。3周后，分離黑質和紋狀體組織，用常規(guī)western blotting檢測各蛋白的表達變化。
　　結果：
　　1.多巴胺細胞中多巴胺 D2樣受體的表達情況：PC12細胞主要表達多巴胺D2受體，MES23.5細胞上同時表達多巴胺D2及D3受體，低分化的SH-

5、SY5Y細胞上很少表達多巴胺D2受體，D3受體幾乎不表達，RA/TPA誘導SH-SY5Y細胞分化后多巴胺D2受體表達有所增加，D3受體則明顯增加。
　　2. D2樣受體激動劑對細胞自噬水平及存活的影響：1）與對照組相比，多巴胺D2樣受體激動劑普拉克索在一定劑量范圍內（10-100μM）呈濃度和時間依賴性地促使PC12、MES23.5和誘導分化的SH-SY5Y細胞內LC3-II和Beclin1蛋白表達增加、而P62蛋白水平明顯下降；

6、喹吡羅（另一個經典的多巴胺D2樣受體激動劑）作用于PC12細胞后也觀察到類似的現(xiàn)象；而普拉克索右旋對映體（幾乎無多巴胺D2樣受體激動活性）作用于 PC12細胞未觀察到上述蛋白水平的變化。普拉克索（100μM）作用于未分化的SH-SY5Y（多巴胺D2樣受體表達較低）也未觀察到上述蛋白水平的變化；巴弗洛霉素 A1(抑制自噬體和溶酶體融合)和氯喹（抑制溶酶體酶活性）存在時，普拉克索和喹吡羅仍然可以增加LC3-II水平；上述兩個多巴胺D2樣受體

7、激動劑作用于PC12細胞后，LAMP1和LAMP2蛋白水平均無變化。2）免疫熒光觀察到普拉克索作用的PC12細胞內EGFP-LC3點狀聚集明顯增加，轉染RFP-GFP-LC3的PC12細胞內GFP、RFP點狀聚集均顯著增加，而且RFP點狀聚集增加更為明顯；3）原代培養(yǎng)的大鼠中腦神經元中，普拉克索作用后LC3熒光點狀聚集明顯增多；4）透射電鏡觀察到普拉克索及喹吡羅處理12 h后PC12細胞內自噬小體形成明顯增多；5）特異性多巴胺 D2，D

8、3受體抑制劑存在時，普拉克索不能促使多巴胺能細胞中上述自噬相關蛋白水平改變。6）在上述研究使用的劑量范圍內（普拉克索不高于100μM、喹吡羅不高于10μM），這些D2樣受體激動劑作用24 h, PC12細胞活力并沒有明顯變化，也未發(fā)生明顯凋亡。上述結果充分表明，以普拉克索為代表的多巴胺D2樣受體激動劑可以誘導并增加多巴胺細胞內的自噬水平，且在一定濃度范圍內對多巴胺能細胞活力沒有明顯影響。
　　3.相關機制研究結果：普拉克索作用于

9、PC12細胞后引起：1）c-Fos蛋白表達隨時間依賴性增加；2）p-CaMKIV(Thr196)和p-CREB(S133)的磷酸化水平明顯增加；3）p-JNK(Thr183/Tyr185)和 p-c-Jun(S63)的磷酸化水平及 c-jun總蛋白水平沒有明顯變化；4）普拉克索和喹吡羅未能下調p-mTOR(S2248), p-p70S6K(Thr389)及p-ULK1(S757)位點的磷酸化水平及上調p-ULK1(S555)的磷酸化水平

10、；與經典的饑餓誘導的自噬（使PC12細胞處于EBSS溶液中）相比，相反在30 min到1 h普拉克索能顯著上調p-mTOR(S2248)和p-p70S6K(Thr389)及p-ULK1(S757)的磷酸化水平；5）BECN1 mRNA水平隨普拉克索濃度增加而增加；免疫共沉淀（Co-IP）發(fā)現(xiàn)普拉克索及喹吡羅作用后Beclin1和PtdIns3K蛋白結合明顯增加；6）普拉克索促進PC12細胞內游離鈣離子水平增加，去除細胞內鈣離子后，普拉克

11、索無法使c-Fos、Beclin1和LC3-II蛋白水平增加；7）BECN1基因沉默后，普拉克索并不能使LC3-II增加；Beclin1蛋白過表達，LC3-II水平明顯增加；8）c-Fos基因沉默后，Beclin1和LC3-II均無明顯增加；而c-Fos過表達，Beclin1和LC3-II均明顯增加；9）染色質免疫共沉淀（ChIP）結果顯示c-Fos可與BECN1上游類似經典的AP-1（5'-TGCCTCA-3）位點結合；10)熒光素酶

12、雙標實驗發(fā)現(xiàn)普拉克索可使BECN1啟動子活性增加，這個AP-1位點缺失突變后則無法增加。
　　4.普拉克索對易聚集蛋白的降解作用結果：1）普拉克索可促進魚藤酮處理后正常及過表達WT、A53T和A30P-SNCA的PC12細胞內α-synuclein蛋白的降解；2）腹腔注射普拉克索對正常及 A53T-SNCA小鼠黑質及紋狀體內自噬水平有增高趨勢,且α-synuclein蛋白蓄積有一定程度的減少；3）普拉克索可促進Htt-552-18