1、背景和目的：
　　 白血病是世界范圍內(nèi)常見的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，是一種細(xì)胞分化障礙性疾病，其核心問題是白血病細(xì)胞失去進(jìn)一步分化為成熟細(xì)胞的能力而停滯在細(xì)胞發(fā)育的不同階段。人紅白血病細(xì)胞株K562最初源于一位慢性髓性白血病患者的胸膜滲出液，K562細(xì)胞攜有Ph染色體t(9;22)(q34; q21)，9號染色體abl基因與22號染色體bcr基因由于染色體異常重組形成bcr/abl融合基因，翻譯產(chǎn)生P210蛋白，該蛋白是致病的主要原因

2、，其具有增強(qiáng)酪氨酸激酶的活性。K562細(xì)胞在體外可被誘導(dǎo)向紅系分化，表現(xiàn)為抑制該細(xì)胞的惡性增殖能力，以及具有相應(yīng)的紅系成熟標(biāo)志。以β-珠蛋白是否表達(dá)來判斷其是否真正的向紅系細(xì)胞方向分化。研究證明，小鼠紅白血病細(xì)胞(MEL)、K562細(xì)胞、人早幼粒白血病HL-60細(xì)胞等造血系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞，都可以通過誘導(dǎo)分化劑在體外促進(jìn)其向終末方向分化，并表達(dá)終末分化產(chǎn)物，從而使這些腫瘤細(xì)胞失去惡性增殖的能力。因此利用誘導(dǎo)分化物使癌細(xì)胞的增殖和基因的活動趨于

3、正常，使基因表達(dá)亦趨于正常，為腫瘤的治療領(lǐng)域提供了新策略。
　　 目前誘導(dǎo)分化療法是腫瘤研究的新領(lǐng)域，尤其是白血病的治療，使惡性腫瘤細(xì)胞能夠在體內(nèi)外分化誘導(dǎo)劑的作用下向正常細(xì)胞方向分化逆轉(zhuǎn)。K562細(xì)胞是體外研究腫瘤細(xì)胞惡性表達(dá)調(diào)控的極好模型，因為他能夠向多種血細(xì)胞系方向分化。因此分化策略主要是將K562細(xì)胞向紅系方向誘導(dǎo)分化。其中，全反式維甲酸誘導(dǎo)分化治療已成為治療急性早幼粒細(xì)胞白血病(Acute promyelocytic

4、leukemia，APL)的首選手段。隨著對白血病誘導(dǎo)分化機(jī)制的深入研究和動物實驗的開展，誘導(dǎo)分化療法將成為白血病臨床治療的主攻方向，但目前仍有諸多問題阻礙著其應(yīng)用:1、誘導(dǎo)分化的具體機(jī)制尚未明確;2、誘導(dǎo)分化劑本身毒副作用大。因此白血病誘導(dǎo)分化相關(guān)基因或治療靶點的發(fā)現(xiàn)將是解決這些問題的突破點。
　　 水通道蛋白(Aquaporin，AQP)是一組小分子跨膜蛋白家族，參與水的快速跨膜轉(zhuǎn)運。對于水通道蛋白的認(rèn)識最開始主要是基于AQ

5、P1的結(jié)構(gòu)分析，AQP1是第一個被發(fā)現(xiàn)的AQPs蛋白，Agre因此獲得了2003年的諾貝爾化學(xué)獎，之后陸續(xù)發(fā)現(xiàn)哺乳動物水通道家族有13個成員(AQP0—AQP12)，其基因結(jié)構(gòu)、基因表達(dá)調(diào)控、染色體定位、蛋白結(jié)構(gòu)、組織分布和生理功能均得到了較為深入的研究。AQP1能使紅細(xì)胞適應(yīng)環(huán)境中血漿的滲透壓變化，通過調(diào)節(jié)水的運輸使紅細(xì)胞膨脹或皺縮。促紅細(xì)胞生成素可使紅細(xì)胞容積瞬間增高，胞膜AQP1密度也大大增高。研究發(fā)現(xiàn)氧氣除了在紅細(xì)胞膜上自由擴(kuò)散

6、，也能夠在AQP1運輸和擴(kuò)散。因此AQP1既是紅細(xì)胞胞內(nèi)胞外水進(jìn)出交換的通道，同樣也是紅細(xì)胞運輸和交換氣體的通道，AQP1不僅是水通道蛋白，還是氧氣氧分子進(jìn)出細(xì)胞的通道。
　　 大量研究顯示AQP1的功能或表達(dá)異常與多種腫瘤的發(fā)生關(guān)系密切。用丁酸鹽誘導(dǎo)HEL細(xì)胞向紅系分化后，AQP1的轉(zhuǎn)錄表達(dá)明顯增加，在人紅白血病K562細(xì)胞中也出現(xiàn)了同樣的結(jié)果。重要的是在AQP1啟動子中包含CACCC元件，該元件具有紅細(xì)胞特異性，并且AQP1

7、啟動子的活性在K562和HEL細(xì)胞中是非紅系細(xì)胞的24倍。無論是9-順式維甲酸(9-cisretinoic acid)還是全反式維甲酸(all-transretinoic acid)，AQP1啟動子中含有的維甲酸(retinoic acid，RA)反應(yīng)元件可通過與RA結(jié)合誘導(dǎo)人紅白血病細(xì)胞細(xì)胞表達(dá)AQP1，并且隨著RA劑量增加，AQP1的表達(dá)明顯增加，維甲酸誘導(dǎo)的AQP1蛋白主要在細(xì)胞質(zhì)膜上表達(dá)。另外，還有研究發(fā)現(xiàn)除了RA，二甲亞砜和皮

8、質(zhì)類固醇亦可誘導(dǎo)小鼠MEL細(xì)胞表達(dá)AQP1。以上研究可以看出多種促紅系分化的藥物都可增強(qiáng)AQP1的表達(dá)，說明紅白血病細(xì)胞的紅系分化調(diào)控和AQP1的表達(dá)可能有著密切聯(lián)系。
　　 目前對于AQP1基因的功能研究還多局限于與液體吸收或分泌有關(guān)的上皮細(xì)胞及可能協(xié)同水跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運的內(nèi)皮細(xì)胞中。AQP1高表達(dá)在紅白血病細(xì)胞向紅系分化過程的作用如何及其具體機(jī)制，有待進(jìn)一步研究。因此在以前的研究基礎(chǔ)上，結(jié)合國內(nèi)外文獻(xiàn)資料，首次將AQP1作為靶基因

9、，構(gòu)建AQP1基因的真核表達(dá)重組載體，在K562細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)，同時采用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體shRNA表達(dá)系統(tǒng)對K562細(xì)胞中AQP1基因表達(dá)進(jìn)行長效抑制，研究AQP1的高表達(dá)和表達(dá)抑制對K562細(xì)胞向紅系分化過程及生理生化各項指標(biāo)的影響，深入研究AQP1基因在細(xì)胞誘導(dǎo)分化中的功能，以期進(jìn)一步明確AQP1基因與白血病發(fā)生機(jī)制之間的關(guān)系，為臨床誘導(dǎo)分化治療白血病提供新的治療靶點。
　　 目的：
　　 確定AQP1與K562細(xì)胞紅

10、系分化的相關(guān)性。構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)AQP1基因的K562-AQP1細(xì)胞系以及穩(wěn)定抑制AQP1基因表達(dá)的K562-shAQP1細(xì)胞系。比較三種不同細(xì)胞系K562、K562-AQP1、K562-shAQP1在腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)分化、生長增殖等方面的差異，明確AQP1基因的在紅系分化中的新功能。應(yīng)用生物信息學(xué)方法比較K562細(xì)胞與AQP1表達(dá)增高或降低的K562細(xì)胞中大量相關(guān)基因表達(dá)的變化，從而發(fā)現(xiàn)一組疾病相關(guān)基因在特定條件下的相互作用，為臨床誘導(dǎo)分化治

11、療白血病提供一組新的治療靶點。
　　 方法：
　　 1.使用RA處理K562細(xì)胞，收集24 h、48 h及72 h的細(xì)胞，同時設(shè)立未加RA的K562細(xì)胞為對照組。采用RA誘導(dǎo)K562細(xì)胞向紅系分化之后，通過Real-time PCR法檢測紅系指標(biāo)γ-globin的表達(dá)變化;分光光度法檢測血紅蛋白(hemoglobin)含量，研究RA對K562細(xì)胞紅系分化的影響。為了研究APQ1基因與K562細(xì)胞紅系分化的關(guān)聯(lián)，使用Rea

12、l-time PCR法、蛋白質(zhì)印跡法檢測RA誘導(dǎo)后K562細(xì)胞AQP1 mRNA和蛋白表達(dá)水平。
　　 2.以人腦cDNA文庫為模板，通過PCR擴(kuò)增出AQP1基因的編碼序列，構(gòu)建pBABE-puro-AQP1真核表達(dá)載體;轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞，篩選建立穩(wěn)定過表達(dá)AQP1基因的K562細(xì)胞株(K562-AQP1); real-time PCR法、細(xì)胞免疫熒光染色法及蛋白質(zhì)印跡法檢測AQP1轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平。通過MTT法檢測細(xì)胞生長增

13、殖、real-time PCR法檢測紅系指標(biāo)γ-globin表達(dá)和分光光度法檢測血紅蛋白含量，研究AQP1過表達(dá)對K562細(xì)胞紅系分化、增殖的影響。
　　 3.設(shè)計特異AQP1 shRNA序列，構(gòu)建pSUPER-retro-puro重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞，篩選建立穩(wěn)定抑制AQP1基因表達(dá)的K562細(xì)胞株(K562-shAQP1); real-time PCR法、細(xì)胞免疫熒光染色法及蛋白質(zhì)印跡法檢測AQP1轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平。

14、通過Real-time PCR和紫外分光光度計法比較K562-shAQP1細(xì)胞株與對照組細(xì)胞在RA誘導(dǎo)后紅系指標(biāo)γ-globin和hemoglobin的表達(dá)，研究AQP1在RA誘導(dǎo)K562細(xì)胞紅系分化中的作用，能否阻斷RA誘導(dǎo)的K562細(xì)胞紅系分化。
　　 4.比較三種不同細(xì)胞系K562、K562-AQP1、K562-shAQP1在腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)分化、生長增殖等方面的差異，明確AQP1基因的在紅系分化中的新功能。
　　 5

15、.利用K562細(xì)胞和AQP1過表達(dá)的K562細(xì)胞所生成的全基因組表達(dá)譜芯片，獲取共同表達(dá)差異基因，然后應(yīng)用GO、Pathway等生物信息學(xué)方法比較相關(guān)基因表達(dá)的變化，從而發(fā)現(xiàn)一組白血病相關(guān)基因在特定條件下的相互作用，為臨床誘導(dǎo)分化治療白血病提供一組新的治療靶點。
　　 6.本文統(tǒng)計分析采用SPSS13.0。計量資料的統(tǒng)計描述用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式給出，兩組比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組比較的情況下用one-way ANOVA，重復(fù)

16、測量資料采用重復(fù)資料的方差分析;兩兩之間的比較，方差齊時用LSD法，不齊則用Dunnett's T3檢驗法。檢驗水準(zhǔn)設(shè)為P＜0.05。
　　 結(jié)果：
　　 1.RA體外誘導(dǎo)K562細(xì)胞紅系分化Real-time PCR檢測RA處理K562細(xì)胞不同時間后紅系分化指標(biāo)γ-globin mRNA的表達(dá)增加，48 h時表達(dá)增加最顯著（可達(dá)未加RA處理組的10.05倍），且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=20.191，P=0.008）。紫

17、外分光光度計法進(jìn)行K562細(xì)胞hemoglobin含量的測定結(jié)果顯示，RA誘導(dǎo)后的K562細(xì)胞hemoglobin含量較對照K562細(xì)胞增加，且隨RA作用時間延長含量遞增，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=651.197，P＜0.001）。
　　 2.AQP1基因表達(dá)與K562細(xì)胞紅系分化的相關(guān)性Real-time PCR檢測RA誘導(dǎo)K562細(xì)胞紅系分化后AQP1基因mRNA的表達(dá)較對照組均有所增加（24h、48h、72h與對照組相比分別

18、為8.23、12.81、12.57倍），不同水平間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=18.834，P=0.009）;Westernblot結(jié)果也顯示AQP1蛋白表達(dá)量也隨RA作用時間延長而遞增。
　　 3.AQP1基因穩(wěn)定過表達(dá)與K562細(xì)胞紅系分化和增殖成功構(gòu)建AQP1基因的真核表達(dá)載體之后，使用免疫組化法鑒定K562細(xì)胞中AQP1的表達(dá)。AQP1經(jīng)一抗孵育后用goat anti-rabbit IgG-R熒光二抗顯色為紅色，DAPI進(jìn)行

19、核復(fù)染顯色為藍(lán)色，將抗原顯色部分與核染色部分疊加在一起觀察抗原表達(dá)的變化。結(jié)果顯示K562-AQP1細(xì)胞中紅色熒光較對照組K562細(xì)胞增強(qiáng)，表明pBaBb-puro-AQP1逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染K562細(xì)胞后，AQP1蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)增多。
　　 Real-time PCR和Western blot檢測K562-AQP1細(xì)胞中AQP1 mRNA和蛋白表達(dá)情況。Real-time PCR檢測結(jié)果顯示K562-AQP1細(xì)胞中AQP1

20、mRNA的表達(dá)較對照組增加，較對照細(xì)胞增高700倍以上，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=24.845，P=0.002）;Western blot結(jié)果顯示K562-AQP1細(xì)胞中AQP1蛋白表達(dá)量也有所增加。
　　 Real-time PCR結(jié)果顯示，在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染AQP1基因真核表達(dá)載體的K562-AQP1細(xì)胞中γ-globin mRNA的表達(dá)較對照K562細(xì)胞有所增加(7.369∶1)，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=24.965，P=0.0

21、01)。紫外分光光度計法的測定結(jié)果顯示，AQP1穩(wěn)定過表達(dá)細(xì)胞株血紅蛋白含量較對照K562細(xì)胞有所增加（增加49％），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=26.561，P＜0.001)。
　　 MTT法檢測K562-AQP1細(xì)胞的生長曲線結(jié)果顯示，AQP1過表達(dá)組(K562-AQP1)較對照組(K562)細(xì)胞的生長速度降低（F=171.36，P=0.001），說明AQP1在促進(jìn)K562細(xì)胞向紅系分化的同時對細(xì)胞增殖有抑制作用。
　　

22、 4.AQP1基因表達(dá)抑制與K562細(xì)胞誘導(dǎo)分化篩選建立穩(wěn)定抑制AQP1基因表達(dá)的K562細(xì)胞株(K562-shAQP1)之后，細(xì)胞免疫熒光染色法檢測AQP1在K562細(xì)胞中的表達(dá)改變結(jié)果顯示，AQP1熒光顯色為紅色，定位在細(xì)胞膜上，K562-shAQP1細(xì)胞膜上紅色熒光較對照組K562細(xì)胞有所減少，表明pSUPERretro-puro-shAQP1逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染K562細(xì)胞后，AQP1蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)受到抑制。
　　 用

23、Real-time PCR法檢測K562-shAQP1細(xì)胞中AQP1基因mRNA的表達(dá)結(jié)果顯示，K562-shAQP1細(xì)胞中AQP1 mRNA的表達(dá)較對照組有所下降，表達(dá)量約為對照組的27％，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-34.138，P=0.001);Western blot結(jié)果顯示K562-shAQP1細(xì)胞中AQP1蛋白表達(dá)量也有所降低，Bandleade軟件分析內(nèi)對照GAPDH與目的蛋白條帶灰度比，抑制效率達(dá)89.8％。
　　

24、 通過比較K562-shAQP1細(xì)胞株與對照組細(xì)胞在RA誘導(dǎo)后紅系指標(biāo)γ-globin和hemoglobin的表達(dá)，研究AQP1在RA誘導(dǎo)K562細(xì)胞紅系分化中的作用，能否阻斷RA誘導(dǎo)的K562細(xì)胞紅系分化。用Real-time PCR法檢測γ-globin mRNA表達(dá)結(jié)果顯示，RA作用于AQP1表達(dá)下調(diào)的K562-shAQP1細(xì)胞系24h、48h、72h的γ-globin mRNA表達(dá)量為2.348、2.926、2.836，與RA處

25、理的對照K562細(xì)胞組(6.709、9.561、8.284)相比有所下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=53.062，P＜0.001）。紫外分光光度計法的測定結(jié)果顯示，RA處理的K562-shAQP1細(xì)胞系hemoglobin含量與RA處理的對照K562細(xì)胞比較也有有所降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=1.736，P=0.177）。當(dāng)RA誘導(dǎo)K562細(xì)胞紅系分化時，下調(diào)AQP1表達(dá)可抑制RA的誘導(dǎo)分化作用。
　　 5.應(yīng)用全基因組表達(dá)譜芯

26、片分析AQP1基因?qū)562細(xì)胞紅系誘導(dǎo)分化的作用機(jī)制本研究重點分析K562組與K562-AQP1組之間的差異表達(dá)基因，其中363個基因表達(dá)上調(diào)，421個基因表達(dá)下調(diào)。這些差異表達(dá)基因的GO分類有317個，分析發(fā)現(xiàn)差異基因的生物學(xué)途徑主要與氧氣運輸、程序性凋亡以及紅系分化等相關(guān);分子功能則與氧氣運輸活性相關(guān)，證實AQP1基因的過表達(dá)確實能促進(jìn)紅系分化并且在該進(jìn)程中發(fā)生細(xì)胞凋亡;差異表達(dá)基因的細(xì)胞組成多為血紅蛋白復(fù)合物，證實AQP1過表達(dá)

27、能顯著增加K562細(xì)胞血紅蛋白的表達(dá)，表現(xiàn)出紅系分化的顯著特征。
　　 將K562組和K562-AQP1組共同上調(diào)和下調(diào)的基因經(jīng)過整理篩選，上傳至STRING分析這兩組的差異基因所編碼蛋白質(zhì)的相互關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有24個基因編碼的蛋白質(zhì)的相互作用主要集中在核心位置。將上述24個基因上傳至pSTIING工具，進(jìn)一步分析這些基因及其轉(zhuǎn)錄因子的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，其中7個差異基因仍然處在重要結(jié)點位置，分別是:POLR2L、SOS1、CDKN1

28、A、PIN1、NCOA3、ATF3、FOS。再根據(jù)參與重要分子通路的基因、以及在重要GO term有所富集的基因使用pSTIING工具進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)圖譜的構(gòu)建，有5個基因位于重要結(jié)點位置，分別是:TRIB3、CDKN1A、DDIT3、ATF3、ALCAM。最終將這12個基因?qū)⑦M(jìn)行下一步的文獻(xiàn)挖掘，以探討與白血病以及紅系分化之間的聯(lián)系。
　　 FACTA文本挖掘工具對10個差異表達(dá)基因進(jìn)行進(jìn)一步的分析比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其中大部分都與白血病

29、相關(guān)，并且大多數(shù)基因存在大量的相關(guān)文獻(xiàn)報道，為白血病紅系分化分子靶標(biāo)的篩選提供明確有力的支持。相關(guān)文獻(xiàn)挖掘的結(jié)果發(fā)現(xiàn)FOS、ATF3在白血病中高表達(dá)，促進(jìn)白血病細(xì)胞的增殖;SOS1、NCOA3這2個基因經(jīng)文獻(xiàn)查閱跟白血病沒有直接關(guān)系，但是通過信號通路或者與相關(guān)基因融合而參與白血病的發(fā)生，在白血病的治療以及預(yù)后起到負(fù)面作用;并且這4個基因在本研究中均發(fā)生了下調(diào)。另外，與紅系分化相關(guān)的血紅蛋白HBD、HBE1、HBG2、HBQ1在K562-

30、AQP1細(xì)胞中均差異表達(dá)上調(diào)，其中HBD基因的差異表達(dá)最顯著，因此推測AQP1與血紅蛋白表達(dá)關(guān)系密切，并且在紅系分化過程中存在著共表達(dá)作用。
　　 預(yù)計后期再加以實驗驗證。下一步再加上AQP1表達(dá)抑制的表達(dá)譜芯片進(jìn)行共同研究，從中再篩選出特異性和實用性更強(qiáng)的基因，作為白血病臨床診斷的分子靶標(biāo)候選基因。還要確定AQP1參與的信號通路以及如何發(fā)揮誘導(dǎo)血紅蛋白表達(dá)的功能。
　　 結(jié)論：
　　 本研究通過基因增加、基因抑

31、制、Real-time PCR、Western Blot等分子生物學(xué)方法，采用γ-珠蛋白、血紅蛋白表達(dá)，細(xì)胞增殖曲線作為紅系分化檢測指標(biāo)，對水通道蛋白1（AQP1基因）在K562細(xì)胞紅系分化中的作用進(jìn)行了研究，取得以下研究結(jié)果:
　　 1.維甲酸(RA)誘導(dǎo)K562細(xì)胞紅系分化的過程中，紅系分化指標(biāo)γ-珠蛋白、血紅蛋白表達(dá)均明顯增加;并且AQP1 mRNA及蛋白的表達(dá)顯著增加。確定了AQP1表達(dá)與K562細(xì)胞紅系分化的相關(guān)性;<

32、br>　　 2.通過構(gòu)建pBABE-puro-AQP1真核表達(dá)載體確定了AQP1過表達(dá)可以顯著促進(jìn)K562細(xì)胞向紅系分化，同時抑制細(xì)胞增殖。
　　 3.AQP1基因的表達(dá)抑制可部分阻斷RA誘導(dǎo)的紅系分化作用，證實AQP1基因在RA誘導(dǎo)K562細(xì)胞紅系分化過程中發(fā)揮重要作用，提示AQP1基因可能作為治療紅白血病新的靶基因。
　　 4.以K562-AQP1和K562為對象，利用全基因組表達(dá)譜芯片獲取差異表達(dá)基因進(jìn)行分析。選

33、取8個與AQP1基因相關(guān)的基因，分別是:差異表達(dá)下調(diào)基因FOS、ATF3、SOS1、NCOA3，以及差異表達(dá)上調(diào)基因HBD、HBE1、HBG2、HBQ1。推測這些基因與紅系分化相關(guān)，預(yù)計后期再加以實驗驗證并進(jìn)行深入研究。
　　 本研究的創(chuàng)新之處1.研究AQP1的表達(dá)變化在紅白血病細(xì)胞紅系誘導(dǎo)分化中的作用及機(jī)制，國內(nèi)外未見報道，有明顯創(chuàng)新。
　　 2.本課題從基因增強(qiáng)、基因抑制正反兩個方面研究AQP1的作用，采用高特異性的