1、目的： 1．了解心肌條件培養(yǎng)液有無誘導(dǎo)心肌干細(xì)胞（CSCs）向心肌細(xì)胞分化的作用。 2．CSCs與心肌細(xì)胞接觸對CSCs分化有何影響。 方法： 1．將新生1-2天小鼠心臟組織剪成0．5-1mm3碎片，用DPBS洗滌紅細(xì)胞，輕微消化組織塊后，進行貼壁培養(yǎng)11-14天后，用胰酶進行差速消化并采集原代CSCs。 2．用免疫磁珠分選原代細(xì)胞得到c-Kit+CSCs。 3．流式細(xì)胞術(shù)分析未分選的原代

2、細(xì)胞表面CD45、CD34、Sca-1、c-Kit標(biāo)志。分選后細(xì)胞檢測c-Kit標(biāo)志純度及細(xì)胞周期。 4．結(jié)合原位免疫熒光檢驗c-Kit+的純度。 5．分選后的c-Kit+CSCs分3組進行培養(yǎng)。 a．空白對照組，無干預(yù)因素，用1％血清培養(yǎng)液培養(yǎng)CSCs21天。 b．條件液組添加心肌細(xì)胞條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)CSCs21天。用1％血清培養(yǎng)液培養(yǎng)心肌細(xì)胞48小時后得到心肌條件培養(yǎng)液。方法示意圖見附圖尾頁。

3、 c．混合培養(yǎng)組分別用PKH26和DAPI標(biāo)記CSCs后與心肌細(xì)胞混合共培養(yǎng)8天，期間均以1％血清培養(yǎng)液培養(yǎng)。 PKH26標(biāo)記的CSCs用于免疫組化鑒定，并與空白組和條件液進行對比；DAPI標(biāo)記的CSCs，共培養(yǎng)后再進行消化分離并分散傳代，改用10％血清培養(yǎng)液，2周內(nèi)，觀察并尋找來源于CSCs，帶DAPI標(biāo)記的單獨搏動細(xì)胞。 6．觀察各組CSCs形態(tài)變化，當(dāng)空白組、條件液組和PKH26標(biāo)記的混合培養(yǎng)組的細(xì)胞完成培養(yǎng)

4、后，用原位免疫組化法鑒定肌鈣蛋白T（Troponin-T）和間隙連接蛋白43（connexin43），評估CSCs向心肌細(xì)胞分化的程度，每組檢測一種蛋白需要6個培養(yǎng)樣本，其中1個用于陰性對照。 7．分析試驗數(shù)據(jù)：原位免疫組化每孔隨機抽四周+中央五個200倍視野，計數(shù)陽性細(xì)胞和陰性細(xì)胞后進行x2檢驗或秩和檢驗分析，以P<0．05為差異具有顯著性?；旌吓囵B(yǎng)組中評估在心肌細(xì)胞附近的CSCs。 結(jié)果： 1．原代未分選的細(xì)

5、胞主要表達干細(xì)胞標(biāo)志c-Kit和Sca-1，低表達造血干細(xì)胞標(biāo)志CD34和白細(xì)胞標(biāo)志CD45。 2．分選后得到純度較高的c-Kit+CSCs，流式細(xì)胞術(shù)分析其純度約96％，原位免疫熒光檢驗也支持以上結(jié)果。 3．分選后的c-Kit+CSCs中處于S期和G2期的細(xì)胞比例約34．6％，說明其染色體復(fù)制和細(xì)胞分裂較活躍。 4．空白組CSCs在低血清條件下增殖活力較差，部分細(xì)胞死亡；條件液組中CSCs增殖活力稍好，細(xì)胞平均

6、密度是空白組的2倍?？瞻捉M和條件液組均未出現(xiàn)自發(fā)搏動的細(xì)胞。混合培養(yǎng)組中與心肌細(xì)胞接觸的CSCs形態(tài)飽滿，并與心肌細(xì)胞同步搏動。分離混合培養(yǎng)的細(xì)胞，可見少數(shù)單獨搏動的帶DAPI標(biāo)記的細(xì)胞。 5．原位免疫組化技術(shù)：經(jīng)過21天后，心肌條件培養(yǎng)液不能有效的誘導(dǎo)CSCs分化成熟至表達心肌細(xì)胞特異的Troponin-T和connexin43蛋白，條件液組與空白組比較無顯著性差異。而CSCs與心肌細(xì)胞接觸8天后，能表達上述兩種蛋白，與空白組