1、microRNAs(miRNAs)是存在于真核生物中具有調(diào)控功能的內(nèi)源性非編碼RNA，大小通常為19-25個(gè)長(zhǎng)度的核苷酸。研究表明，miRNA通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)原理調(diào)控靶基因mRNA表達(dá)，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、脂肪代謝及胚胎器官形成等多種生理功能。miR-218（miRNA-218）是一種首先被發(fā)現(xiàn)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中有高表達(dá)的miRNA，目前關(guān)于miR-218的研究主要集中在惡性膠質(zhì)細(xì)胞瘤，miR-218可以通過(guò)調(diào)節(jié)不同靶基因參與調(diào)

2、控膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲、遷移、增殖及腫瘤干細(xì)胞的全能性，這已成為惡性膠質(zhì)細(xì)胞瘤臨床研究的一個(gè)熱點(diǎn)。而在心臟發(fā)育領(lǐng)域，近幾年僅有少量關(guān)于miR-218相關(guān)研究報(bào)道。在斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育過(guò)程中，miR-218可以通過(guò)與Tbx5之間互相調(diào)控而影響心臟發(fā)育，miR-218表達(dá)被抑制后可以抵消部分由于TBX5過(guò)表達(dá)后引起的心臟循環(huán)發(fā)育阻滯。過(guò)表達(dá)miR-218后可引起斑馬魚(yú)胚胎心臟發(fā)育畸形、心房發(fā)育不全、心室間隔無(wú)法正常形成等現(xiàn)象。但miR-218可能調(diào)

3、控的靶基因及參與心肌細(xì)胞分化的作用機(jī)制尚未完全闡明。并且斑馬魚(yú)細(xì)胞中miR-218分型與哺乳動(dòng)物細(xì)胞中miR-218分型不同，斑馬魚(yú)細(xì)胞中miR-218不同亞型參與心臟發(fā)育不同過(guò)程的調(diào)控。因此，亟待在哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育代表性強(qiáng)的體系中加以研究。小鼠胚胎干(embryonic stem，ES)細(xì)胞自首次從小鼠胚囊內(nèi)層細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)后，因可以在體外適宜條件下無(wú)限制增殖并具有分化成所有體細(xì)胞的全能性而在各種研究中得到廣泛應(yīng)用。已有報(bào)道m(xù)iR-1和m

4、iR-133參與調(diào)控胚胎心肌分化發(fā)育及心血管的形成，Let-7家族也可參與調(diào)控心血管疾病的發(fā)生及ES細(xì)胞定向心肌分化過(guò)程。miR-218參與調(diào)控ES細(xì)胞全能性的維持。另在口腔鱗狀細(xì)胞癌中miR-218通過(guò)靶基因Rictor參與調(diào)控腫瘤的發(fā)生和遷移。而干細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞之間存在著驚人的相似性，因此，影響腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、遷移等功能的某些信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，在控制干細(xì)胞功能中同樣發(fā)揮著重要作用。ES細(xì)胞體外定向心肌細(xì)胞分化過(guò)程伴隨著細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)，

5、擬胚體(embryonid bodies，EBs)的形成過(guò)程模擬了ES細(xì)胞體內(nèi)形成三胚層原腸胚的過(guò)程，其中涉及包括細(xì)胞的分裂增殖，遷移，聚集和重排在內(nèi)的一系列形態(tài)發(fā)生運(yùn)動(dòng)。有文獻(xiàn)表明，miR-124參與EBs形成過(guò)程中細(xì)胞遷移的調(diào)控，miR-124表達(dá)上調(diào)后抑制EB鋪展以及ES細(xì)胞遷移，并抑制ES細(xì)胞分化。miR-218可以通過(guò)靶基因Robo1調(diào)控Slit/Robo1信號(hào)通路，并調(diào)節(jié)遷移相關(guān)蛋白Cdc42和黏附相關(guān)蛋白R(shí)ac1的表達(dá)，影

6、響惡性膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞的遷移。但迄今尚未見(jiàn)有關(guān)miR-218對(duì)ES細(xì)胞定向分化心肌細(xì)胞及分化中伴隨的細(xì)胞遷移作用報(bào)道。本研究主要利用小鼠ES細(xì)胞體外定向分化為心肌細(xì)胞模型，探索miR-218在ES細(xì)胞定向心肌細(xì)胞分化過(guò)程中的調(diào)控作用，并進(jìn)一步采用生物信息學(xué)方法，通過(guò)miRNA靶基因數(shù)據(jù)庫(kù)如Targetscan、miRanda、Pictar等，對(duì)特定miRNA可能的靶基因進(jìn)行序列分析及預(yù)測(cè)，并采用miRNA分析數(shù)據(jù)庫(kù)如miRPath、Tar

7、base和MicroT-CDS等對(duì)靶基因進(jìn)行功能分類(lèi)，并利用PCR法對(duì)預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行基因表達(dá)水平的鑒定。旨在闡明miR-218表達(dá)調(diào)控與ES細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞間的關(guān)系，揭示miR-218潛在可能參與調(diào)控心肌分化過(guò)程的靶基因，為深入研究miR-218在ES細(xì)胞分化中的作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　目的：探索miR-218對(duì)小鼠ES細(xì)胞定向分化心肌細(xì)胞的調(diào)控作用及miR-218潛在可能參與調(diào)控心肌細(xì)胞分化的靶基因。闡明miR-218表達(dá)調(diào)

8、控與ES細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞間的相關(guān)性，揭示ES細(xì)胞分化過(guò)程中miR-218轉(zhuǎn)錄后調(diào)控分子信息。
　　方法：采用經(jīng)典的“懸滴培養(yǎng)-懸浮培養(yǎng)-貼壁培養(yǎng)”三步法ES細(xì)胞定向心肌細(xì)胞分化模型，利用miR-218擬似物(miR-218 mimic)和miR-218抑制劑（miR-218 inhibitor）分別轉(zhuǎn)染小鼠ES細(xì)胞，檢測(cè)搏動(dòng)心肌細(xì)胞團(tuán)分化率變化，并運(yùn)用免疫印跡技術(shù)、流式細(xì)胞術(shù)和免疫熒光染色法檢測(cè)小鼠ES細(xì)胞中miR-218的表達(dá)

9、調(diào)控與心肌細(xì)胞定向分化過(guò)程中心肌特異性轉(zhuǎn)錄因子及心肌細(xì)胞特異性蛋白水平的表達(dá)，心肌細(xì)胞數(shù)量，鈣離子通道相關(guān)蛋白表達(dá)變化及心肌肌小節(jié)成熟結(jié)構(gòu)的形成情況。采用活細(xì)胞工作站測(cè)定分化來(lái)的心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+瞬變。通過(guò)生物信息學(xué)分析ES細(xì)胞中可能與miR-218互補(bǔ)結(jié)合的靶基因序列，并運(yùn)用RT-PCR及qRT-PCR檢測(cè)miR-218 mimic對(duì)部分預(yù)測(cè)出可能靶基因的表達(dá)水平影響。根據(jù)預(yù)測(cè)結(jié)果，進(jìn)而利用劃痕法和Transwell法檢測(cè)miR-

10、218對(duì)ES細(xì)胞體外分化中伴隨的遷移現(xiàn)象的調(diào)控作用，并用免疫印跡技術(shù)探究miR-218對(duì)ES細(xì)胞定向心肌分化過(guò)程中細(xì)胞遷移相關(guān)蛋白的影響。
　　結(jié)果：⑴miR-218 mimic轉(zhuǎn)染小鼠ES細(xì)胞后，抑制心肌細(xì)胞分化，在day5+2和day5+3時(shí)心肌細(xì)胞分化率分別為12±3％和32±7％，較陰性對(duì)照組29±4％和56±5％顯著減少（P＜0.01）。中胚層特異性標(biāo)記蛋白brachyury，心肌特異性轉(zhuǎn)錄因子Nkx2.5、GATA4、

11、TBX5，肌小節(jié)結(jié)構(gòu)蛋白α-Actinin，竇房結(jié)樣心肌細(xì)胞特異性蛋白HCN4，心房樣心肌細(xì)胞特異性蛋白ANP及心室樣心肌細(xì)胞特異性蛋白MLC-2v，橋粒蛋白Desmoplakin，間隙連接蛋白Cx43和鈣相關(guān)蛋白N-cadherin的表達(dá)均呈現(xiàn)顯著性下降。同時(shí)，miR-218 mimic顯著降低day5+3心肌細(xì)胞內(nèi)咖啡因刺激后Ca2+瞬變幅度。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，ES細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-218 mimic后分化成心肌細(xì)胞數(shù)量減少。并

12、且，免疫熒光結(jié)果顯示miR-218 mimic組分化而來(lái)的心肌細(xì)胞肌小節(jié)結(jié)構(gòu)紊亂。而miR-218 inhibitor轉(zhuǎn)染ES細(xì)胞后，能促進(jìn)心肌細(xì)胞分化時(shí)相提前。在day5+1時(shí)就出現(xiàn)搏動(dòng)心肌細(xì)胞團(tuán)，分化率為4±3％。在day5+2和day5+3時(shí)心肌細(xì)胞分化率分別為68±4％和84±8％，較陰性對(duì)照組29±5％和56±7％顯著增加（P＜0.01）。miR-218 inhibitor促進(jìn)中胚層特異性標(biāo)記蛋白brachyury的表達(dá)，Nk

13、x2.5、GATA4、TBX5、α-Actinin、HCN4、ANP、MLC-2v、L-type Ca2+ CPα1D、CaMKⅡδ、Desmoplakin、Cx43和N-cadherin蛋白表達(dá)水平均上調(diào)。miR-218 inhibitor增加α-Actinin陽(yáng)性表達(dá)的心肌細(xì)胞數(shù)，且促進(jìn)分化而來(lái)的細(xì)胞肌小節(jié)結(jié)構(gòu)清晰完整，顯著提高day5+3心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+瞬變幅度。⑵生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)分析出164個(gè)miR-218的可能靶基因，經(jīng)m

14、iRNA功能分析數(shù)據(jù)庫(kù)miRPath發(fā)現(xiàn)miR-218參與調(diào)控20條信號(hào)通路。結(jié)合預(yù)測(cè)結(jié)果及文獻(xiàn)報(bào)道，選擇了其中四條與心肌分化相關(guān)的信號(hào)通路中部分靶基因進(jìn)行基因水平的驗(yàn)證，具體包括磷脂酰肌醇信號(hào)系統(tǒng)(Phosphatidylinositol signaling system)，谷氨酸的突觸調(diào)控通路（Glutamatergic synapse），細(xì)胞間連接(Gap junction)和mTOR信號(hào)調(diào)控系統(tǒng)中的Rictor、Pik3r1、P

15、i4k2a、Adcy1、Shank2、Pdgfr-α、Grm1和Gnai2。PCR結(jié)果顯示，miR-218 mimic可以顯著下調(diào)Rictor、Pik3r1、Shank2、Pdgfr-α、Grm1基因水平的表達(dá)。⑶基于miR-218靶基因預(yù)測(cè)并驗(yàn)證出的靶基因Pdgfr-α、Grm1和Rictor，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，其可以參與心肌分化發(fā)育調(diào)控，并調(diào)控腫瘤細(xì)胞遷移，同時(shí)細(xì)胞遷移在小鼠ES細(xì)胞定向心肌分化發(fā)育過(guò)程中也發(fā)揮著重要的作用，本實(shí)驗(yàn)對(duì)mi

16、R-218表達(dá)與小鼠ES細(xì)胞心肌分化中的遷移能力調(diào)控進(jìn)行了進(jìn)一步的探究。在小鼠ES細(xì)胞定向心肌細(xì)胞分化過(guò)程中，miR-218 mimic組EBs鋪展遷移最遠(yuǎn)細(xì)胞距EBs邊緣的平均距離為431.1μm，顯著大于對(duì)照組EBs細(xì)胞遷移平均距離350.1μm，miR-218表達(dá)上調(diào)促進(jìn)EBs細(xì)胞遷移，miR-218 inhibitor組EBs細(xì)胞遷移距離為235.9μm，顯著小于對(duì)照組遷移距離318.7μm。體外劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-218

17、mimic轉(zhuǎn)染后ES細(xì)胞遷移距離在12 h和24 h較陰性對(duì)照組都有顯著增加，劃痕愈合面積比增大。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-218 mimic組平均每個(gè)視野遷移的ES細(xì)胞數(shù)目為180個(gè)，較陰性對(duì)照組的120個(gè)顯著增加，提示miR-218mimic具有促進(jìn)小鼠ES細(xì)胞體外遷移作用。該作用可能與miR-218通過(guò)下調(diào)靶基因Grm1，Pdgfr-α及Rictor的表達(dá)，進(jìn)而抑制細(xì)胞遷移相關(guān)蛋白R(shí)ac1和Cdc42表達(dá)有關(guān)。

18、>　　結(jié)論：①在小鼠ES細(xì)胞體外定向分化為心肌細(xì)胞過(guò)程中，miR-218表達(dá)量與心肌分化密切相關(guān)，miR-218 mimic可抑制ES細(xì)胞定向中胚層分化，抑制心肌細(xì)胞分化。而miR-218 inhibitor的作用則相反。②通過(guò)生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-218可能參與細(xì)胞內(nèi)20條信號(hào)通路的164個(gè)基因的表達(dá)調(diào)控。其中與心肌分化相關(guān)的4條信號(hào)通路中，miR-218 mimic可以顯著下調(diào)Rictor、Pik3r1、Shank2、Pdg

19、fr-α、Grm1基因水平的表達(dá)，可作為miR-218調(diào)控ES細(xì)胞定向分化心肌細(xì)胞作用機(jī)制的重要靶點(diǎn)進(jìn)行深入研究。③miR-218表達(dá)量與ES細(xì)胞定向心肌分化過(guò)程中EB細(xì)胞的鋪展能力相關(guān)，miR-218 mimic可以促進(jìn)ES細(xì)胞的體外遷移能力，miR-218 inhibitor的作用則相反。miR-218參與ES細(xì)胞遷移的調(diào)控作用可能與調(diào)節(jié)靶基因Grm1、Pdgfr-α和Rictor表達(dá)，影響細(xì)胞遷移相關(guān)蛋白R(shí)ac1和Cdc42表達(dá)有