1、山東理工大學山東理工大學山東理工大學山東理工大學碩士學位論文東亞三角渦蟲東亞三角渦蟲DjtryDjtryDjtryDjtry基因的表達、功能及基因的表達、功能及酶活測定酶活測定ExpressionExpressionExpressionExpressionfunctionalfunctionalfunctionalfunctionalanalysisanalysisanalysisanalysisofofofofDjtryDjtryDj

2、tryDjtryenzymeenzymeenzymeenzymeactivityactivityactivityactivitydetectiondetectiondetectiondetectionfromfromfromfromplanarianplanarianplanarianplanarianDugesiaDugesiaDugesiaDugesiajaponicajaponicajaponicajaponica研究生：周魯明周

3、魯明指導教師：趙博生趙博生教授教授申請學位門類級別：理學碩士學碩士學科專業(yè)名稱：生物化學與分子生物學生物化學與分子生物學研究方向：分子細胞生物學分子細胞生物學論文完成日期：20122012年4月1515日單位代碼：10433104331043310433學號：Y0906205Y0906205Y0906205Y0906205分類號：密級：山東理工大學碩士學位論文摘要I摘要東亞三角渦蟲(Dugesiajaponica)是扁形動物門的代表動物

4、，首次出現(xiàn)了兩側對稱和中胚層，具有極強的身體可塑性和再生能力，已經成為研究動物進化、胚胎發(fā)育及再生的重要模式動物。胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶廣泛存在于動物體中，并行使多種功能，包括食物消化、血淋巴凝結、抗菌活性、黑色素合成以及免疫信號通路激活等，具有典型的His(H)、Asp(D)和Ser(S)催化三聯(lián)體結構。從東亞三角渦蟲cDNA文庫中獲得編號為1218271的cDNA克隆，序列全長706bp，含有一個609bp的最大開放閱讀框(F)編碼

5、有203個氨基酸組成的蛋白質，推測其分子量約為22.6KDa。序列經NCBIBLASTP程序比對，發(fā)現(xiàn)該基因具有完整編碼框的胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶(TrypsinlikeserineproteaseTryp_SPc)，將其命名為Djtry，另外其胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶結構域(Tryp_SPcdomain)中含有不完全保守的催化三聯(lián)體結構，其中第一位的His被Lys取代，故我們推測Djtry為絲氨酸蛋白酶家族同系物。系統(tǒng)進化分析表明，Dj

6、try是一種原始的胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶。我們利用Nthern雜交的方法，對Djtry基因是否在東亞三角渦蟲中存在和大小進行了鑒定。結果發(fā)現(xiàn)陽性信號為單一條帶，且大小約為700bp，與我們得到的cDNA大小一致。利用整體原位雜交檢測整體和再生的渦蟲以及渦蟲各時期的胚胎發(fā)現(xiàn)，整體和再生的渦蟲中，Djtry均在腸組織中特異性表達，而在渦蟲胚胎發(fā)育各階段，Djtry也伴隨著腸的形成而表達，是一種腸的分子標記。利用RealtimePCR檢測經大

7、腸桿菌和食物刺激之后不同時間點Djtry在渦蟲體內的表達變化，分析Djtry可能發(fā)揮的功能。結果發(fā)現(xiàn)經過細菌攻擊之后Djtry的表達量上升而食物刺激后表達量相對平穩(wěn)，因此我們推斷Djtry可能參與渦蟲的先天免疫反應，抵御外界細菌的侵入。為了研究這種突變型的胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶是否也具有胰蛋白酶的活性，我們通過構建原核表達載體，在大腸桿菌中誘導表達，發(fā)現(xiàn)Djtry以包涵體的形式大量表達，經過對表達的重組蛋白進行變性、純化、復性以及Wes