1、日本三角渦蟲(chóng)（Dugesia japonica）隸屬扁形動(dòng)物門(mén)(Platyhelminthes)，渦蟲(chóng)綱(Turbellaria)，在動(dòng)物系統(tǒng)演化中占有重要地位，并且具有極強(qiáng)的再生能力。目前，雖然已克隆大量與渦蟲(chóng)再生相關(guān)的基因，但其具體的再生機(jī)制及相關(guān)基因的功能仍不清楚。
　　本文從日本三角渦蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出再生過(guò)程中持續(xù)上調(diào)表達(dá)但表達(dá)量較低的熱休克蛋白70和90家族的Djhsp70e、Djhsp90a、Djhsp90b和D

2、jhsp90c基因。利用整體原位雜交、RNA干擾和Real time-PCR等分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)四基因的時(shí)空表達(dá)模式和功能進(jìn)行分析，結(jié)果如下:
　　(1)通過(guò)Real time-PCR技術(shù)對(duì)切割損傷、離子液體暴露、冷應(yīng)激和熱應(yīng)激環(huán)境下日本三角渦蟲(chóng)體內(nèi)四基因的表達(dá)量進(jìn)行分析，結(jié)果顯示:在應(yīng)激條件下，四基因的表達(dá)量均明顯上調(diào)，并且隨著切割損傷時(shí)間的延長(zhǎng)、離子液體濃度的升高，四基因的表達(dá)量逐漸上升。
　　(2)日本三角渦蟲(chóng)Djhsp

3、70e基因的cDNA長(zhǎng)度為1982bp，5'端有180bp非編碼區(qū)，3'端有38bp的非翻譯區(qū)，其中包含一個(gè)長(zhǎng)度為1764bp的最大開(kāi)放閱讀框(ORF)，編碼一個(gè)由587個(gè)氨基酸構(gòu)成的蛋白質(zhì)，含有兩個(gè)熱休克蛋白70家族所特有的標(biāo)簽序列。原位雜交結(jié)果顯示:在整體中，該基因在除腦及咽部以外的身體各部分廣泛表達(dá)，身體兩側(cè)和腸支處雜交信號(hào)較強(qiáng);再生個(gè)體的芽基部位有較強(qiáng)的雜交信號(hào)。RNA干擾該基因后，整體渦蟲(chóng)出現(xiàn)嚴(yán)重頭部溶解且不能再生，而頭再生尾

4、片段也出現(xiàn)嚴(yán)重的溶解現(xiàn)象。Real time-PCR結(jié)果表明:干擾該基因后，Djpiwi-1和Djpiwi-b的表達(dá)量明顯下調(diào)。
　　(3)日本三角渦蟲(chóng)Djhsp90a基因cDNA長(zhǎng)為3212bp，包括5'端1039bp的非編碼區(qū)和3'端22bp的非編碼區(qū)，其中包含一個(gè)長(zhǎng)度為2151bp的ORF，編碼一個(gè)由716個(gè)氨基酸構(gòu)成的蛋白質(zhì)。其中包含6個(gè)熱休克蛋白90家族所特有的序列標(biāo)簽。原位雜交結(jié)果顯示:在整體渦蟲(chóng)中雜交信號(hào)主要分布在除

5、腦及咽以外的大部分實(shí)質(zhì)組織中;在再生個(gè)體中的芽基部位有較強(qiáng)雜交信號(hào)。RNA干擾該基因后，整體渦蟲(chóng)出現(xiàn)明顯的頭部溶解現(xiàn)象并伴有身體持續(xù)性皺縮;頭再生尾片段再生被抑制;尾再生頭片段與對(duì)照比沒(méi)有明顯變化。Real time-PCR結(jié)果表明:干擾該基因后，Djpiwi-1和Djpiwi-b的表達(dá)量明顯下調(diào)。
　　(4)日本三角渦蟲(chóng)Djhsp90b基因的cDNA長(zhǎng)度為2636bp，5'端有94bp的非編碼區(qū)和3'端有132bp非編碼區(qū)，含有

6、2409bp的最大開(kāi)放閱讀框，編碼一個(gè)由802個(gè)氨基酸構(gòu)成的蛋白質(zhì)。該基因所推導(dǎo)的氨基酸序列含有5個(gè)HSP90家族所特有的標(biāo)簽序列。整體原位雜交結(jié)果顯示:該基因在整體渦蟲(chóng)實(shí)質(zhì)組織中廣泛表達(dá)且身體兩側(cè)有較強(qiáng)的雜交信號(hào);再生個(gè)體的芽基部位雜交信號(hào)較強(qiáng)。RNA干擾該基因后，整體渦蟲(chóng)身體出現(xiàn)明顯的皺縮;頭再生尾和尾再生頭片段再生速度緩慢。Real time-PCR結(jié)果表明:干擾該基因后，Djpiwi-1和Djpiwi-b的表達(dá)量明顯下調(diào)。

7、>　　(5)日本三角渦蟲(chóng)中Djhsp90c基因的cDNA長(zhǎng)為2573bp，其中包含一個(gè)長(zhǎng)度為2394bp的最大開(kāi)放閱讀框，編碼一個(gè)由797bp氨基酸編碼的蛋白質(zhì)，5'端有114bp的非編碼區(qū)，3'端有65bp的非編碼區(qū)。包含6個(gè)HSP90家族基因所特有的標(biāo)簽序列。原位雜交結(jié)果顯示:該基因在整體渦蟲(chóng)中雜交信號(hào)主要分布在身體兩側(cè)及尾部;再生片段芽基部位有較強(qiáng)的雜交信號(hào)。RNA干擾該基因后，整體渦蟲(chóng)口部?jī)蓚?cè)出現(xiàn)膨脹現(xiàn)象;頭再生尾和尾再生頭片段

8、再生受到抑制。Realtime-PCR結(jié)果表明干擾該基因后，Djpiwi-1、Djpiwi-b和Djh2b基因的表達(dá)量顯著下調(diào)。
　　以上結(jié)果表明:渦蟲(chóng)體內(nèi)Djhsp70e、Djhsp90a、Djhsp90b和Djhsp90c基因在應(yīng)激條件均具有細(xì)胞保護(hù)作用;四基因通過(guò)調(diào)控干細(xì)胞維持渦蟲(chóng)體內(nèi)組織平衡，并在再生過(guò)程中起重要作用。除此之外，Djhsp90c基因通過(guò)調(diào)節(jié)Djpiwi-b和Djh2b基因調(diào)節(jié)渦蟲(chóng)體內(nèi)干細(xì)胞的增殖和分化，是渦