1、甲基溴作為一種土壤熏蒸劑被廣泛應(yīng)用于大棚溫室等設(shè)施農(nóng)業(yè)，但是由于CH3Br對(duì)大氣平流層的臭氧有著極強(qiáng)的破壞作用，聯(lián)合國蒙特利爾公約要求發(fā)展中國家必須在2015年停止使用，因此迫切需要開發(fā)一種能夠滿足環(huán)境要求的新型甲基溴替代技術(shù)。
　　 對(duì)于鹵代甲烷的研究除了在生態(tài)學(xué)和環(huán)境保護(hù)方面有重要的價(jià)值，他的源和匯及其酶促反映機(jī)制的研究也具有重要的意義。鹵代甲烷的來源是豐富多樣的，除了甲基溴熏蒸劑在土壤中的大量使用外還包括海水的分解釋放、生

2、物燃燒釋放、大量燃料的燃燒產(chǎn)生、微生物和陸地植物的產(chǎn)生釋放等。MeX的生物合成酶促反應(yīng)：SAM+X-(Cl-，Br-，I-)→CH3X+S-adenosylhomocysteine(S-腺苷高半胱氨酸)，該反應(yīng)是由一種鹵代甲烷甲基轉(zhuǎn)移酶(methyl chloride transferase MCT)催化完成的。鹵素底物對(duì)酶的親和性排列順序?yàn)镮->Br->Cl-，但是氟離子不能進(jìn)行該酶促反應(yīng)。根據(jù)甲基碘的釋放量測定植物是否含有鹵代甲烷甲

3、基轉(zhuǎn)移酶活性的實(shí)驗(yàn)推測，大部分高等植物都具有MCT酶活性。利用基因工程的手段，把編碼MCT酶的基因轉(zhuǎn)化到對(duì)氯離子敏感的作物中，有可能提高植物的耐鹽性。模式植物擬南芥也產(chǎn)生和釋放鹵代甲烷，而行使此功能的主要的酶是由HOL(HARMLESS TO OZONE LAYER)基因編碼的，該酶屬于甲基轉(zhuǎn)移酶家族，能催化依賴SAM底物的Cl-、Br-、I-的甲基化，對(duì)該基因的系統(tǒng)發(fā)生學(xué)分析表明在維管植物中廣泛存在著產(chǎn)生鹵代甲烷的能力。
　　

4、 植物寄生線蟲是一種危害農(nóng)作物的重要病原生物，其對(duì)農(nóng)作物的危害已經(jīng)超過了細(xì)菌和病毒，在引起植物侵染性病害的四大病原中僅次于真菌。它具有在自然界分布廣泛、種類繁多等特點(diǎn)，同時(shí)它能促使真菌和細(xì)菌易于侵染植物，從而成為誘發(fā)植物病害的重要原因之一。目前對(duì)各種農(nóng)作物根結(jié)線蟲防治的方法有：藥物(如甲基溴熏蒸)防治、生物制劑(如線蟲生防細(xì)菌)防治等。
　　 在之前的研究中，根據(jù)高等植物能夠天然產(chǎn)生甲基鹵化合物的特點(diǎn)，將利用RACE技術(shù)從擬南芥

5、、鹽芥、鹽地堿蓬葉中克隆到鹵代甲烷甲基轉(zhuǎn)移酶基因AtMCT、ThMCT和SsMCT，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)將基因轉(zhuǎn)入經(jīng)濟(jì)作物煙草，經(jīng)Southern、Northern分析表明外源基因已經(jīng)導(dǎo)入并在煙草中實(shí)現(xiàn)了異源表達(dá)。
　　 本實(shí)驗(yàn)用不同離子濃度的培養(yǎng)液處理野生型和AtMCT轉(zhuǎn)基因煙草，測定其鹵代甲烷釋放量、氯離子含量、鈉鉀離子含量、葉綠素含量及生物量等指標(biāo)。轉(zhuǎn)基因煙草的鹵代甲烷釋放量明顯高于野生型對(duì)照。在不同鈉離子和氯離子濃度處理下，轉(zhuǎn)

6、基因煙草葉綠素含量增高，鈉離子含量降低，鉀離子含量升高，比野生型煙草的耐逆性增強(qiáng)。本研究的目的是實(shí)現(xiàn)煙草在不受Cl-脅迫的前提下施用經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的KCl肥料，從而提高植物體內(nèi)的鉀離子含量，以改良轉(zhuǎn)基因煙草的品質(zhì)，同時(shí)實(shí)現(xiàn)植物自身釋放的CH3Br能夠抑制植物線蟲病害，減少外源化學(xué)藥品的使用。
　　 把三種基因在原核細(xì)胞中表達(dá)，發(fā)現(xiàn)AtMCT大部分以可溶性蛋白形式存在于裂解細(xì)胞的上清中，與其同源性很高的ThMCT一部分表達(dá)為親水性蛋白、

7、一部分表達(dá)為疏水性蛋白，而堿篷的SsMCT則以包涵體的形式存在沉淀中。為了尋找造成原核表達(dá)時(shí)AtMCT和ThMCT在上清中表達(dá)而SsMCT以包涵體的形式在沉淀中表達(dá)的區(qū)別，將ThMCT序列上兩個(gè)與AtMCT有差別的兩個(gè)氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行了點(diǎn)突變和雙突變，經(jīng)過改造的ThMCT基因ThA32E，ThL49Q，ThA32EL49Q表達(dá)的蛋白在存在形式上有了較大的變化，均變?yōu)榱舜蟛糠挚扇艿挠H水性蛋白。
　　 用Ni-組氨酸吸附瓊脂糖珠親和層

8、析法純化原核表達(dá)的可溶性融合蛋白AtMCT-His、ThMCT-His、ThMCTA32E-His、ThMCTL49Q-His、ThMCTA32EL49Q-His以及包涵體蛋白SsMCT-His，均得到單一條帶的融合蛋白。
　　 通過與底物反應(yīng)時(shí)甲基鹵化物的釋放量來測定鹵代甲烷-甲基轉(zhuǎn)移酶活性，在只有酶和底物反應(yīng)的情況下，SsMCT酶對(duì)碘的活性很高，而鹽處理后，大量的氯離子對(duì)碘離子形成競爭性抑制，三種酶對(duì)碘的合成活性都有所降低，